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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Mikroskop-Setup für Zeitraffer-Bildgebung
1. Bestimmen der Lasereinstellungen
1. Bestimmung der zu verwendenden Laserwellenlänge. Verwenden Sie eine Wellenlänge, die doppelt so groß ist wie die Anregungswellenlänge des interessierenden Fluorophors (z. B. Wellenlänge zwischen 880 und 940 nm für grün fluoreszierendes Protein (GFP).
HINWEIS: In der vorliegenden Studie lag die Wellenlängeneinstellung für GFP zwischen 880 und 940 nm. Je höher die Wellenlänge, desto geringer ist die Ausgangsleistung des Lasers.
2. Bestimmen Sie die Lasertransmission. Ein hoher Prozentsatz der Laserübertragung tötet den Embryo, verwenden Sie die niedrigste Transmissionsstufe (empfohlen). Für 24 bis 48 Stunden Zeitrafferstudien, wie hier vorgestellt, halten Zeitrafferstudien, wie sie hier vorgestellt werden, die Übertragung unter 5%.
3. Bestimmen Sie die Mikroskop-Detektionssysteme und stellen Sie sicher, dass die richtigen Filter für das Fluorophor vorhanden sind.
HINWEIS: Für Multiphotonenmikroskope gibt es mehrere Detektionssysteme mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten für die emittierte Fluoreszenz. Im Allgemeinen hat ein internes Detektionssystem eine geringere Empfindlichkeit als ein externes Detektionssystem. Für transgene Linien mit hoher GFP-Expression ist das interne Nachweissystem ausreichend. Für transgene Linien mit geringer GFP-Expression oder mit anderen Fluorophoren (z. B. rot fluoreszierendes Protein) kann ein externes Detektionssystem erforderlich sein, um den Prozentsatz der Lasertransmission auf einem vernünftigen Niveau zu halten. Unabhängig vom verwendeten Nachweissystem müssen die richtigen Filter für das Fluorophor vorhanden sein.
2. Anpassen der Softwareeinstellungen am Multiphotonenmikroskop
1. Lokalisieren Sie den Embryo mit dem 5X-Objektiv. Heben Sie den Tisch manuell in die höchste Position und verwenden Sie den Feinfokus, um den Embryo in der Mitte des Mikroskopbereichs zu positionieren.
2. Senken Sie den Tisch manuell ab und ändern Sie das 5X-Objektiv gegen das 25X-Wasserimmersionsobjektiv (numerische Apertur NA, 0,95). Heben Sie die Bühne vorsichtig an, um den Embryo wieder in den Fokus zu bringen.
3. Klicken Sie in der Software auf den "xyzt"-Modus, um mehrere Bilder in Zeitintervallen (t) in der x-y-Ebene über eine Tiefe von "z" zu erhalten. Verwenden Sie die Epifluoreszenz- oder Hellfeldansicht, um die Tiefenschärfe im interessierenden Bereich zu ermitteln, der den Z-Stapel abgrenzt.
1. Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche "Beginnen"; für diese Experimente war der seitliche Rand des Auges der Anfang des Z-Stapels. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ende"; Die Mittellinie des Embryos war das Ende des Z-Stapels.
HINWEIS: Die Schrittweite betrug 0,3-0,6 μm und es gab insgesamt ~200 Schritte für eine Z-Stapelgröße von 60 bis 120 μm).
4. Klicken Sie auf das Menü, um die Aufnahmezeit und die Bildfrequenz anzupassen.
Für das derzeitige System benötigen ~200 Schritte ca. 5 Minuten für jede Z-Stack-Erfassung. Für eine angemessene Rückgewinnung des Fluorophors und das Überleben des Embryos ist ein Verhältnis von mindestens 1:3 zwischen der Z-Stapel-Erfassung (Laser-Einschalten) und der Erholungszeit (Laser-Leistung aus) zu berücksichtigen.
HINWEIS: Zum Beispiel werden Z-Stapel alle 20 Minuten erfasst, wobei 5 Minuten die Z-Stapel-Erfassung und 15 Minuten die Wiederherstellung erfolgen. Für dieses Protokoll können größere Z-Stacks erhalten werden, aber die Zeit zwischen den Z-Stack-Aufnahmen würde angemessen verlängert, was zu weniger Bildern über den Zeitrafferverlauf führt.
1. Mit entsprechender Zeit für die Embryogenesung stellen Sie die Zeit zwischen den Z-Stapeln im dafür vorgesehenen Fenster ein. Legen Sie die Gesamtdauer des Experiments im entsprechenden Fenster fest.
5. Abschließende Software-, Laser- und Embryo-Anpassungen.
1. Schalten Sie die Livebild-Einstellung ein, um letzte Anpassungen an den Lasereinstellungen vorzunehmen. Passen Sie die Schieberegler für Laserübertragung, Verstärkung und Offset innerhalb der Software an, um das Fluoreszenzbild zu optimieren. Passen Sie auch die Ausrichtung des Embryos nach Bedarf an, abhängig von der Länge des Experiments, dem erwarteten Wachstum des Embryos usw. Stellen Sie sicher, dass der Interessenbereich während der gesamten Dauer des Experiments innerhalb des Rahmens bleibt.
2. Schalten Sie die Epifluoreszenzlichtquelle aus, da sie während der Zeitrafferaufnahme nicht mehr benötigt wird. Decken Sie die Bühne mit der Laserschutzbox ab (Abbildung 1I). Bei Verwendung des internen Detektionssystems ist die Laserschutzbox ausreichend zum Schutz vor Hintergrundlicht. Drücken Sie auf "Start".
HINWEIS: Bei empfindlicheren externen Erkennungssystemen blockiert die Laserschutzbox jedoch nicht genügend Hintergrundlicht, und es sind zusätzliche Abdeckungen erforderlich, um eine Unterbrechung der Bildaufnahme zu verhindern.
2. Während der Zeitrafferaufnahme
1. Befüllen Sie die offene Badkammer alle 8-12 Stunden (mindestens 2 Mal pro Tag) während der Zeitrafferaufnahme durch die Schiebetüren an der Lasersicherheitsbox mit Zeitraffer-Embryomedien (Abbildung 1I).
2. Bevor Sie die Türen der Lasersicherheitsbox öffnen, stellen Sie sicher, dass das Mikroskop nicht aktiv ein Bild aufnimmt.
HINWEIS: Die Verwendung von Heizungen und Umlaufmediensystemen ist für Zeitraffer-Bildgebungsexperimente, die 24 bis 48 Stunden dauern, nicht erforderlich. In der Tat sind die Temperaturen sowohl der Tisch- als auch der Inline-Heizgeräte schwer zu kontrollieren, und während der Bildaufnahme zeigt der Embryo eine angemessene Entwicklungsrate in einem Temperaturbereich von 25-28 °C. Darüber hinaus neigen zirkulierende Mediensysteme dazu, überzulaufen und die Anlage möglicherweise zu beschädigen. Daher werden alle Embryonen nach der Entnahme routinemäßig inszeniert.
3. Verarbeitung nach der Erfassung
1. Klicken Sie in der Software auf das Menü "Datei" und wählen Sie "Speichern".
2. Öffnen Sie die Datei in einer Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle). Markieren Sie die richtige Bildserie. Wählen Sie in der Software das Menü "Prozess". Klicken Sie auf 3D-Entfaltung und "Anwenden", um jeden Z-Stapel zu entfalten.
HINWEIS: Die Datei ist groß; Daher kann dieser Schritt viele Stunden dauern.
3. Klicken Sie in der Software unter dem Menü "Prozess" auf "Maximale Projektion". Klicken Sie auf "Übernehmen", um die maximale Projektion zu starten und 1 Bild pro Z-Stapel zu erzeugen. Exportieren Sie jede maximal projizierte Datei (1 Bild pro Z-Stapel) als TIFF-Datei.
4. Importieren Sie einzelne TIFF-Dateien in eine Videoverarbeitungssoftware. Wählen Sie alle TIFF-Dateien aus und ziehen Sie sie in den Videoeditor. Passen Sie die Länge jedes Bildes innerhalb des Videos auf 0,1 s an. Exportieren Sie Videos als MOV- oder MP4-Datei.
