Visualisierung axonaler Projektionsmuster embryonaler Motoneuronen in Drosophila

1. Zubereitung

1. Bereiten Sie 500 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT)-Lösung vor, indem Sie 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5 ml t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (siehe Materialtabelle) zu 500 ml 1X PBS geben und mindestens 30 Minuten lang umrühren. Bei 4 °C lagern. Die Lösung relativ frisch verwenden und in einer sauberen Flasche aufbewahren.
2. Stellen Sie 10 ml 4%iges Paraformaldehyd her, indem Sie 2,5 ml 16%ige Paraformaldehydlösung und 1 ml 10x PBS zu 6,5 ml deionisiertem Wasser hinzufügen. Bei 4 °C lagern und innerhalb einer Woche verbrauchen.
   VORSICHT: Vermeiden Sie den Hautkontakt mit Paraformaldehydlösung, da diese hochgiftig ist.
3. 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal)-Substrat (10 % w/v X-Gal in Dimethylsulfoxid (DMSO)) herstellen, indem 0,1 g X-Gal-Substrat pro 1 ml DMSO gelöst werden. Bei -20 °C in 100 μl Aliquoten lagern.
4. Herstellung einer X-Gal-Färbelösung mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), 150 mM Natriumchlorid, NaCl, 1 mM Magnesiumchlorid, MgCl₂, 3 mM Kaliumferrocyanid, K₄[FeII(CN)₆], 3 mM Kaliumferricyanid, K₃[FeIII(CN)₆], und 0,3 % t-Octylphenoxypolyethoxyethanol. Bei 4 °C im Dunkeln lagern.
5. Stellen Sie eine 3%ige Wasserstoffperoxidlösung her, indem Sie 30%iges Stammwasserstoffperoxid 1:10 mit deionisiertem Wasser verdünnen.
6. Stellen Sie eine 3,3′-Diaminobenzidin (DAB)-Lösung her, indem Sie 1 Tablette (10 mg) DAB vollständig in 35 ml frischer PBT-Lösung auflösen. Durch einen 0,2-μm-Spritzenvorsatzfilter filtrieren und bei -20 °C in 910 μl Aliquoten lagern.
   ACHTUNG: Entsorgen Sie alle DAB-Abfälle in Bleichmittel, um das DAB zu vernichten.
7. Eierteller mit Apfelsaft zubereiten. 35 g Agar und 1 l entionisiertes Wasser werden in einen 2-l-Kolben gegeben. 33 g Saccharose, 2 g Tegosept und 375 ml Apfelsaft in einen 1-Liter-Kolben geben. Schmelzen Sie sie, indem Sie sie 30 Minuten lang autoklavieren. Lassen Sie beide Lösungen auf etwa 60 °C abkühlen. Kombinieren Sie diese Lösungen und mischen Sie sie gut unter Rühren. Gießen Sie ~11 mL der kombinierten Lösung in eine 60-mm-Kulturschale.
8. Hefepaste herstellen, indem Backhefe in entionisiertes Wasser (Verhältnis 1:0,8) gemischt und bei 4 °C gelagert wird.

2. Embryoentnahme (Tag 1)

1. Sammeln Sie junge weibliche und männliche Fliegen (jünger als 5 Tage) und halten Sie sie 1-2 Tage lang in einem Plastikbecherkäfig mit einer Eiplatte (60 mm x 15 mm), die eine kleine Menge Hefepaste in der Mitte enthält.
2. Für die optimale Entnahme von Embryonen im späten Stadium 16 stellen Sie gegen 17 Uhr einen Flaschenhalter mit Fliegen (> 50) auf und lassen Sie sie 3 h lang bei 25 °C Eier legen.
3. Übertragen Sie die Fliegen in eine Frischfutterflasche.
4. Verschließen Sie die Eierplatte mit dem Deckel und brüten Sie sie kopfüber bei 25 °C in einem befeuchteten Brutkasten (~70% Luftfeuchtigkeit) über Nacht.

3. Vorbereitung der Embryonen für die Immunfärbung (Tag 2)

1. Geben Sie gegen 10:20 Uhr 1,8 ml PBT-Lösung auf die Eiplatte und lösen Sie die Embryonen mit einem Wattestäbchen von der Platte, während Sie sie kippen.
   HINWEIS: Indem du die Hefepaste vorsichtig mit einem Wattestäbchen zerstampfst, löse sie auf, falls eine große Anzahl von Embryonen darauf gefunden wird. Beginnen Sie mit der Entnahme der Embryonen ~40 Minuten vor der Fixierung (ca. 11:00 Uhr).
2. Übertragen Sie die Embryonen von der Eiplatte mit einer 1-ml-Pipettenspitze in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen.
3. Lassen Sie die Embryonen sich absetzen und saugen Sie die PBT-Lösung so weit wie möglich ab. Spülen Sie die Embryonen zweimal mit 1 ml PBT-Lösung. Aspirieren Sie die PBT-Lösung so weit wie möglich.
4. Füllen Sie das Röhrchen mit 1 ml 50%igem Bleichmittel (d.h. in deionisiertem Wasser verdünnt) und dechorionieren Sie die Embryonen, indem Sie sie 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auf einem Nährstoffator inkubieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt tötet die dechorionierten Embryonen nicht.
5. Lassen Sie die dechorionierten Embryonen sich setzen, saugen Sie das 50%ige Bleichmittel so weit wie möglich ab und spülen Sie die Embryonen 3 Mal mit 1 ml PBT-Lösung aus.
6. Fügen Sie 0,5 ml Heptan hinzu und geben Sie anschließend 0,5 ml 4%ige Paraformaldehydlösung bei RT gegen 11:00 Uhr in das Röhrchen.
7. Inkubieren Sie die Embryonen 15 Minuten lang auf einem Nutator bei RT.
8. Entfernen Sie die 4%ige Paraformaldehyd-Lösung (die untere Schicht).
9. Fügen Sie 0,5 ml 100% Methanol hinzu und entgiften Sie die Embryonen, indem Sie das Röhrchen 30 s lang kräftig schütteln.
10. Entfernen Sie das Heptan (d.h. die oberste Schicht).
11. Fügen Sie 0,5 ml 100%iges Methanol hinzu und schütteln Sie das Röhrchen 10 s lang kräftig.
12. Lassen Sie die Embryonen sich setzen, indem Sie auf das Röhrchen klopfen und das Methanol so weit wie möglich aspirieren. Spülen Sie die Embryonen mit 1 ml 100%igem Methanol und schütteln Sie sie weniger als 10 s lang.
    HINWEIS: Längere Exposition gegenüber Methanol zerstört die β-Gal-Aktivität.
13. Entfernen Sie das Methanol und spülen Sie die devitellinisierten Embryonen 3 Mal mit 1 ml PBT-Lösung.

4. Genotypisierung der Embryonen mit LacZ-Färbung (Tag 2)

1. 1 ml PBT-Lösung in das Röhrchen geben und das Röhrchen in einem 37 °C heißen Heizblock oder Wasserbad für 15 Minuten inkubieren.
2. Während der Inkubation X-Gal-Färbelösung (1 ml pro Röhrchen) bei 65 °C in ein Wasserbad geben, bis es trüb wird. Inkubieren Sie es in einem 37 °C warmen Wasserbad.
3. Aspirieren Sie die PBT-Lösung und geben Sie 1 ml X-Gal-Färbelösung und 20 μl X-Gal-Substrat in das Röhrchen.
4. Das Röhrchen wird bei 37 °C mit Nutation inkubiert, bis ein blauer Niederschlag erkennbar ist.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit für den 2. und 3. Blue Balancer liegt im Allgemeinen zwischen 2-4 Stunden.
5. Entfernen Sie die X-Gal-Färbelösung und spülen Sie die Embryonen 3 Mal mit 1 mL RT PBT-Lösung aus.
6. Sortieren Sie mit einer Nadelsonde oder Pinzette die Embryonen des gewünschten Genotyps (d.h. nicht gefärbte weiße Embryonen) mit einem Lichtpräpariermikroskop (1,6X-2,5X-Objektive) von Hand.
   ANMERKUNG: Da einige blaue Balancer, wie z.B. CyO, Aktin-LacZ und TM3, Aktin-LacZ, ein transgenes Konstrukt tragen, das bakterielles β-Gal (LacZ) exprimiert, unter der Kontrolle des Actin-Promotors, enthalten Embryonen, die ubiquitär blau gefärbt sind, eine oder zwei Kopien von blauen Balancer-Chromosomen. Daher sind nicht gefärbte weiße Embryonen homozygot für das gewünschte letale Allel.

5. Immunfärbung von Embryonen mit Anti-Fasciclin II-Antikörpern (Tag 2-3)

1. Sammeln Sie die Embryonen des gewünschten Genotyps (d.h. nicht gefärbte weiße Embryonen) und übertragen Sie sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze in ein 0,5-ml-Mikroröhrchen.
   HINWEIS: In diesem Schritt können die Embryonen grob nach morphologischen Kriterien gestaffelt werden, einschließlich der Segmentierungsmuster der Kutikula und der Strukturen von Kopf und Schwanz. Während der Kopfinvolution, zwischen 10 und 16 Stunden nach der Eiablage, erfährt der Embryo eine ausgeprägte Verkleinerung des vorderen Segments.
2. Waschen Sie die Embryonen einmal mit 0,4 ml PBT-Lösung und fügen Sie 0,3 ml Blockierungslösung hinzu (5 % normales Ziegenserum und 5 % DMSO in PBT-Lösung).
3. Blockieren Sie die Embryonen mit Nutation bei RT für 15 min.
4. Fügen Sie 75 μl Anti-Fasciclin II-Antikörper hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen mit Nutation bei RT über Nacht.
5. Waschen Sie die Embryonen 4 Mal mit 0,4 mL PBT-Lösung für mindestens 20 Minuten pro Waschgang.
6. Geben Sie 0,3 ml Blockierungslösung (5 % normales Ziegenserum in PBT-Lösung) mit Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase (Anti-Maus-HRP)-Antikörper (2 μg/ml) hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen mit Nutation bei RT über Nacht.
7. Waschen Sie die Embryonen 6 Mal mit 0,4 mL PBT-Lösung für mindestens 20 Minuten pro Waschgang.
8. Geben Sie 0,3 ml DAB-Lösung in das Röhrchen.
   ACHTUNG: Tragen Sie Handschuhe und legen Sie alle DAB-Abfälle/Tuben/Spitzen in Bleichmittel.
9. Fügen Sie 2 μl 3%iges Wasserstoffperoxid hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen im Dunkeln mit Nutation bei RT, bis die gewünschte Menge an Niederschlag erzeugt ist.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit für die 1D4-Immunhistochemie liegt im Allgemeinen zwischen 0,5 und 1 h.
10. Waschen Sie die Embryonen 4 Mal mit 0,4 ml PBT-Lösung.
    ACHTUNG: Entfernen Sie die DAB-Lösung und die ersten beiden Wäschen mit einer Pipette und entsorgen Sie sie in Bleichmittel.
11. Geben Sie 0,2 ml 70%ige Glycerin/PBS-Lösung in das Röhrchen und lagern Sie es bei RT oder 4 °C.
    HINWEIS: Halten Sie das Röhrchen von Licht fern. Klarere Präparate können erhalten werden, indem die Embryonen in eine 90%ige Glycerin/PBS-Lösung gelegt werden. Es ist jedoch schwieriger, Embryonen zu präparieren, die in 90%iger Glycerin/PBS-Lösung geklärt wurden, als solche, die in 70%iger Glycerin/PBS-Lösung geklärt wurden.

6. Staging, Präparierung, Montage und Bildgebung der Embryonen (Tag 4)

1. Für das Staging übertragen Sie die mit 70% Glycerin/PBS äquilibrierten Embryonen auf einen Objektträger.
2. Entnehmen Sie Embryonen im späten Stadium 16, bei denen die Nerven des intersegmentalen Nervs (ISN) des abdominalen Bereichs 7 (A7), A8 und A9 zusammenlaufen, um sich zu berühren, oder/und deren Mitteldarm in drei Bänder unterteilt ist.
   HINWEIS: Embryonen, die mit 1D4-Antikörpern gefärbt wurden, können auf der Grundlage der Projektionsmuster von ISN und ISNb motorischen Axonen gestaffelt werden. Nach dem Verlassen des Zentralnervensystems (ZNS) konvergieren die Nerven A7, A8 und A9 ISN, um sich zu berühren, und divergieren anschließend, um sich weit bis zu den Rückenmuskeln zu erstrecken (Pfeilspitze in Abbildung 1A). In Embryonen im mittleren Stadium von 16 erstrecken sich die A7-ISN-Nerven jedoch parallel zu den A8/A9-Nerven (eckige Klammer in Abbildung 1B). Darüber hinaus sind die Projektionsachsen der Nervus A6 ISNb (senkrecht zu den ventrolateralen Muskeln) in beiden Hemisegmenten ungefähr mit dem hinteren Ende der longitudinalen Axonfaszikel des ZNS ausgerichtet (Pfeile und eine Linie in Abbildung 1C). Diese morphologischen Kriterien variieren zwischen den verschiedenen Genotypen. Alternativ können Embryonen auf der Grundlage der Darmmorphologie inszeniert werden. Vor dem Stadium 17 hat der Mitteldarm eine herzähnliche Form, während der Mitteldarm im Stadium 17 in drei Bänder unterteilt ist.
3. Sezieren Sie die Embryonen.
   1. Nehmen Sie jeden Embryo mit einer 1-ml-Spritze aus dem Glycerintropfen und legen Sie ihn mit der Bauchseite nach oben. Schneiden Sie den vorderen Teil bei 1/4 der Körperlänge und die hinterste Region, die frei von motorischen Axonen ist, ab.
   2. Bewegen Sie den endgeschnittenen Embryo mit einer Nadelsonde aus dem Glycerintropfen, rollen Sie ihn mit der Rückenseite nach oben und platzieren Sie ihn horizontal im Feld.
      HINWEIS: Wenn der Embryo aus dem Glycerintropfen herausgenommen wird, macht ein wenig Glycerin, das mit dem Embryo verbunden ist, ihn klebrig.
   3. Schneide den Embryo entlang der dorsalen Mittellinie mit einer einzigen sehr feinen Wolframnadel ab. Machen Sie einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des Embryos und schneiden Sie dann die dorsale Mittellinie in Richtung anterior weiter ab. Schneiden in die entgegengesetzte Richtung ist auch in Ordnung.
   4. Bewegen Sie den mittelliniengeschnittenen Embryo mit einer Nadelsonde in den Glycerintropfen, platzieren Sie ihn mit der Rückenseite nach oben und lösen Sie den Darm von der Körperwand, indem Sie jede Körperwand in ventrolateraler (diagonaler) Richtung entfalten (2,5-faches Objektiv).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die dorsale Mittellinie vollständig geschnitten ist, was zu einer vollständigen Trennung zwischen der linken und der rechten Körperwand führt.
   5. Bewegen Sie den in der Mittellinie geschnittenen Embryo vorsichtig aus dem Glycerintropfen und legen Sie dann mit einer feinen Nadelsonde (2,5-faches Objektiv) zwei Lappen der Körperwand auf den Objektträger.
   6. Entfernen Sie mit einer sehr feinen Wolframnadel die inneren Organe aus dem präparierten Embryo, indem Sie sie seitlich schieben (5X-Objektiv).
      HINWEIS: Eine detailliertere Beschreibung eines anderen ähnlichen Sezierverfahrens finden Sie auf der Website.
4. Zum Einbetten werden 2-3 μl 70%ige Glycerin/PBS-Lösung auf saubere, präparierte Embryonen gegeben und mit einer Feinnadelsonde auf einen neuen Objektträger übertragen, auf den 8 μl 70%ige Glycerin/PBS-Lösung in der Mitte verteilt wurden (2,5-faches Objektiv).
5. Setzen Sie ein Deckglas (18 mm x 18 mm) auf. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit normalem Nagellack (entweder klar oder farbig ist in Ordnung).
6. Nehmen Sie Bilder mit hoher Auflösung (20X-, 40X- und 63X-Ölimmersionsobjektive) unter einem DIC-Lichtmikroskop (Differentialinterferenzkontrast) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf.
   HINWEIS: Eine bessere Visualisierung und phänotypische Charakterisierung, insbesondere für ISNb-Motoraxone, kann durch die Verwendung eines 63X-Ölimmersionsobjektivs erzeugt werden.

Abbildung 1: Staging von Embryonen basierend auf den Projektionsmustern der motorischen Axone ISN und ISNb. (A) In Wildtyp-Embryonen im späten Stadium 16 konvergieren die ISN-Nerven A7, A8 und A9 (Pfeile), um sich gegenseitig zu berühren (Pfeilspitze). Der vordere ist links und der ventrale ist unten. Der Maßstabsbalken = 15 μm. (B) In Wildtyp-Embryonen im mittleren Stadium 16 erstreckt sich der A7-ISN-Nerv parallel zu den A8/A9-Nerven (eckige Klammer). Pfeile zeigen die Nerven A7, A8 und A9 ISN. Der vordere ist links und der ventrale ist unten. Der Maßstabsbalken = 15 μm. (C) Filetierte Präparation von Wildtyp-Embryonen im späten Stadium 16, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden. Die Projektionsachsen (Pfeile) des linken und rechten Nervus A6 ISNb sind grob mit dem hinteren Ende der longitudinalen Axonfaszikel des ZNS ausgerichtet (schwarze Linie). Die Bauchsegmente A1-A7 sind oben beschriftet. Der vordere ist links. Die Maßstabsleiste = 15 μm.