In vivo Bildgebung des Gehirns von Zebrafischlarven zur Visualisierung von Kleinhirnneuronen

Zusammenfassung

Quelle: Schramm, P. et al. In vivo Bildgebung von voll aktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die In-vivo-Bildgebung von Kleinhirnneuronen in transgenen Zebrafischlarven, die fluoreszierende Proteine in Purkinje-Neuronen exprimieren. Der Prozess beinhaltet die Betäubung der Larven, die Immobilisierung in Agarose und die vorsichtige Entfernung der pigmentierten Haut, um die Lichtdurchdringung und die Fluoreszenzintensität zu verbessern. Schließlich werden die präparierten Proben unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet, um die markierten Neuronen deutlich sichtbar zu machen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Anästhesie der Larven und Vorbereitungen für die Einbettung
   1. Zu Beginn des Experiments für den Tag werden die Tiere, die benötigt werden, mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff in eine Petrischale mit 90 mm Durchmesser umgefüllt, die entweder mit Danieau (für Larven, die noch in einer Petrischale mit Danieau gehalten werden) oder mit Wasser aus der Fischanlage (für Larven, die älter als 7 Tage nach der Befruchtung [dpf] sind und gehalten werden in der Fischanlage).
      1. Achten Sie beim Pipettieren von Fischen, die älter als 2 Wochen sind, darauf, dass die Öffnung der Pipette groß genug ist, um Verletzungen des Fisches beim Umfüllen zu vermeiden. Verwenden Sie kein Netz, da dies die Fische, insbesondere die jüngeren Larven, physisch schädigen kann.
   2. Fügen Sie rotifera oder artemia Nauplien hinzu, die für die Größe der in der Petrischale gehaltenen Larven geeignet sind, um freien Zugang zu Nahrung und maximalen Gesundheitszustand der Larven zu gewährleisten und Stress zu reduzieren.
   3. Zum Einbetten werden die ausgewählten Larven in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 mm gegeben, die mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) gefüllt ist. Fügen Sie das erforderliche Volumen an d-Tubocurarin hinzu, um eine Arbeitskonzentration/wirksame Dosis von 10 μM zu erreichen, und warten Sie einige Minuten, bis die Larven vollständig immobilisiert sind.
      HINWEIS: Wenn die Fische älter werden oder wenn eine schnellere Vollnarkose (unter 5 Minuten) erforderlich ist, ist es möglich, die Konzentration von d-Tubocurarin zu erhöhen (LD50 für Mäuse beträgt 0,13 mg/kg intravenös). Es ist auch möglich, ein anderes Anästhetikum zu verwenden, wie z. B. α-Bungarotoxin (Arbeitskonzentration: 1 mg/ml), das die gleiche Wirkung wie Curare hat und das Gehirn ebenfalls voll aktiv hält. Wenn für das interessierende Subjekt kein voll aktives Gehirn erforderlich ist, ist Tricain in einer nicht-letalen Dosis (0,02%) auch eine Option, um die Larven vollständig zu betäuben. Tricain blockiert jedoch die Natriumkanäle und beeinträchtigt dadurch die Gehirnaktivität.
   4. Bereiten Sie die Montagekammer vor, indem Sie den Deckel der Petrischale mit einem Durchmesser von 35 mm nehmen, den Deckel auf den Kopf stellen und ein quadratisches Glasdeckglas (24 x 24 mm) auf die Unterseite des Deckels legen. Siehe Abbildung 1 (oberer Teil) für eine schematische Beschreibung dieser Schritte. Die glattere Oberfläche des Glases verhindert das Abrutschen des Agaroseblocks, der die Larven während des Schädelöffnungsvorgangs enthält.
   5. Aliquotieren Sie die für den Tag benötigte ACSF-Menge in einem geeigneten Fläschchen (z. B. 50-ml-Röhrchen, Becherglas, Schott-Flasche usw.) und sauerstoffreichern Sie es mit Carbogen (5 % CO₂, 95 % O₂). Wenn nur die Morphologie (z. B. Fluoreszenzmuster) abgebildet wird, ist ACSF immer noch notwendig, um die Integrität des Gehirns zu gewährleisten und sicherzustellen, dass die Zellen nicht negativ durch Osmolaritätseffekte beeinflusst werden, aber eine Sauerstoffversorgung des ACSF ist nicht erforderlich. Dieser Schritt muss nur durchgeführt werden, wenn für die Bildgebung die volle Gehirnaktivität erforderlich ist.
      HINWEIS: Für eine optimale Sauerstoffsättigung des Mediums füge am Ende des Carbogenrohrs einen Ausströmerstein hinzu. Um einen ausreichend hohen Sauerstoffgehalt zu gewährleisten, ist es notwendig, das ACSF in den Bildgebungskammern alle 20-60 Minuten gegen frisch sauerstoffhaltiges ACSF auszutauschen, abhängig von der Anzahl und dem Alter der Larven, die in derselben Bildgebungskammer eingebettet sind (z. B. für eine einzelne eingebettete Larve ist ein ACSF-Austausch pro Stunde ausreichend). Bei sechs parallel eingebetteten Larven, die älter als 14 dpf sind, ist ein ACSF-Austausch alle 20 min erforderlich) planen Sie also die notwendige Menge an sauerstoffgesättigtem ACSF entsprechend dem geplanten Versuch ein.
2. Einbettung der Larven
   1. Übertragen Sie die vollnarkotisierten Larven mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff in die (in Schritt 1.4) vorbereitete Montagekammer. Entfernen Sie dann vorsichtig das überschüssige Medium, um eine Verdünnung der niedrigschmelzenden (LM) Agarose zu vermeiden. Alle folgenden Schritte sollten unter einem Stereomikroskop mit ausreichender Vergrößerung durchgeführt werden.
      HINWEIS: Das Kippen der Einbettkammer kann helfen, das Medium vollständig zu entfernen.
   2. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, indem Sie einen ausreichend großen LM-Agarose-Tropfen auf die Larven geben (ca. 1 ml, abhängig von der Größe der Larven), um die Tiere vor dem Austrocknen zu schützen und unnötigen Stress zu reduzieren.
   3. Richten Sie die Larven in Position aus, bevor die Agarose erstarrt. Achten Sie darauf, dass der dorsale Teil der Larven nach oben gerichtet ist. Achten Sie außerdem darauf, die Larven so nah wie möglich an der Oberfläche der Agarose einzubetten.
      HINWEIS: Abhängig von der Größe und Anzahl der Larven, die gleichzeitig eingebettet werden sollen, ist es möglich, die Agarosekonzentration anzupassen. Zum Beispiel wird für 1-3 Larven, die 30 dpf alt sind, eine Konzentration von 1,8%-2% LM-Agarose empfohlen. Für 1-4 Larven, die 7 dpf alt sind, ist es am praktikabelsten, 2,5 % LM-Agarose zu verwenden, während für 5-8 Larven 2 % besser geeignet sind. Wenn ein voll aktives Gehirn erforderlich ist, wird empfohlen, nur drei Fische gleichzeitig einzubetten, um die Zeit zu verkürzen, die für die Operation der Larven benötigt wird. Im Allgemeinen wird empfohlen, niedrigere Konzentrationen (1,8%-2%) zu verwenden, je älter die Larven werden oder je mehr Larven gleichzeitig eingebettet werden sollen.
   4. Wenn Bilder mit einem inversen Mikroskop aufgenommen werden, schneiden Sie den Agaroseblock mit den Larven in eine kleine quaderförmige Form. Dies ist wichtig, um die Larven später in die Bildgebungskammer zu bringen. Bei Verwendung eines aufrechten Mikroskops ist ein solches Trimmen nicht erforderlich, da die Eindeckkammer auch als Bildgebungskammer verwendet werden kann. In Abbildung 1 (oberer Teil) findet man eine schematische Beschreibung dieser Schritte.
3. Das Gehirn freilegen
   HINWEIS: Alle folgenden Schritte sollten mit größter Sorgfalt durchgeführt werden, um die Larven nicht unnötig zu verletzen. Wenn für das Experiment ein voll aktives Gehirn benötigt wird, denken Sie daran, dass das Gehirn mit jeder Sekunde, die vergeht, während der Fisch noch vollständig in Agarose sitzt und einen offenen Schädel ohne sauerstoffreiches ACSF hat, an Sauerstoffmangel leidet und austrocknet. Die Auswirkungen von Sauerstoffmangel werden umso dramatischer, je älter die eingelagerten Larven sind. Daher ist es wichtig, die Operation nicht nur innerhalb kürzester Zeit, sondern auch mit maximaler Präzision durchzuführen, um mechanische Hirnschäden mit der Nadel zu vermeiden. Die Schritte 3.2-3.4 sollten beim Training nicht länger als 30 s pro Fisch dauern.
4. Beginnen Sie mit der Operation, sobald sich die Agarose verfestigt hat. Schneiden Sie zunächst die gesamte überschüssige Agarose über der interessierenden Gehirnregion ab, um freien Zugang zum Kopf und einen freien Arbeitsbereich zu erhalten. Wenn der dorsale Teil des Kopfes bereits aus der Agarose herausragt, überspringen Sie diesen Schritt.
5. Wählen Sie je nach Region von Interesse eine Stelle, um mit der Operation zu beginnen. Nehmen Sie die Glasnadel und machen Sie einen kleinen Schnitt durch die Haut, ohne zu tief in das Gewebe einzudringen. Dies ist der Ausgangspunkt für das Abschälen der darüber liegenden Haut.
   HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, beginnen Sie niemals direkt über dem interessierenden Bereich, um das Risiko zu verringern, wichtige Strukturen zu beschädigen. Falls erforderlich, ist es möglich, hinter dem Hinterhirn zu beginnen und sich nach vorne zu arbeiten, bis die unerwünschte Hautpartie abgezogen ist.
6. Fahren Sie mit sehr kleinen Schnitten entlang des Teils der Haut fort und versuchen Sie, sie zu entfernen, indem Sie die Nadel knapp unter der Oberfläche bewegen. Meistens ist es nicht notwendig, sich komplett um das Gehirn herum zu bewegen und ein kreisförmiges Stück Haut und Schädel herauszuschneiden, sondern einfach zwei Schnitte entlang des Kopfes zu machen und dann die Haut auf die eine oder andere Seite wegzuschieben. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der optimalen Schnittstrategie, um einen freien Zugang zum Kleinhirn zu erhalten.
   HINWEIS: Diese Mikrochirurgie ist ein heikler Eingriff und erfordert höchstwahrscheinlich etwas Training, um die Haut perfekt zu entfernen, ohne das darunter liegende Gehirn zu schädigen. Es wird auch empfohlen, die optimale Schnittstrategie für die interessierende Gehirnregion zu finden und diese für die Dauer des Experiments beizubehalten.
7. Unmittelbar nach dem Entfernen der Haut von allen eingebetteten Larven gießen Sie (sauerstoffhaltiges) ACSF über die Agarose, um unerwünschte Hautpartikel und Blut zu überfluten, das Gehirn voll aktiv zu halten und es vor dem Austrocknen zu schützen.
   HINWEIS: Wenn ein gesundes Gehirn für das Experiment benötigt wird, wird empfohlen, maximal drei Fische auf einmal zu nehmen.
8. Wenn Sie ein aufrechtes Mikroskop verwenden, beginnen Sie direkt mit der Bildgebung.
   1. Wenn Sie ein inverses Mikroskop verwenden, schieben Sie einen kleinen Spatel unter den quaderförmigen Agaroseblock (Schritt 2.4).
   2. Geben Sie einen kleinen Tropfen LM-Agarose auf den Boden der Bildgebungskammer (z. B. Glasbodenschale) und drehen Sie den Agaroseblock mit den Larven sofort mit dem Spatel um 180° und schieben Sie ihn vorsichtig auf den Boden der Bildgebungskammer, während der flüssige Agarosetropfen als Klebstoff dient.
   3. Wenn sich die Agarose verfestigt hat, füllen Sie die Bildgebungskammer mit (sauerstoffhaltigem) ACSF und beginnen Sie dann mit der Bildgebung. Siehe Abbildung 1 (unterer Teil) für eine schematische Beschreibung.
9. Wenn für das Experiment volle Gehirnaktivität erforderlich ist, stellen Sie immer sicher, dass der ACSF in der Bildgebungskammer einen ausreichend hohen Sauerstoffgehalt aufweist. Um dies zu gewährleisten, sollte das Medium alle 20-60 min vorsichtig gegen frisch sauerstoffhaltiges ACSF ausgetauscht werden (abhängig von der Anzahl und Größe des Fisches, der Größe und Oberfläche der Bildgebungskammer und der Bildgebungsdauer).

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematisches Vorgehen zur schrittweisen Präparation von offenen Schädelzebrafischen für in vivo Bildgebung. Die Arbeitsanleitung für die verschiedenen Schritte finden Sie in der Grafik s...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Leica	TCS SP8
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
Glaskapillare Typ 1	WPI	1B150F-4
Glas Kapillare Typ 2	Harvard Gerät	GC100F-10
Glas Deckglas	deltalab	D102424
Bildgebungskammer	Ibidi	81156
LM-Agarose	Condalab	8050.55
Mikroskop Kamera	Leica	DFC9000 GTC
Nadelabzieher Typ 1	NARISHIGE	Modell PC-10
Nadelabzieher Typ 2	Sutter Instruments	Modell P-2000
Pasteur-Pipetten 3ml	A.Hartenstein	20170718
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
35 mm Petrischale	Sarstedt	833900
90 mm Petrischale	Sarstedt	821473001