Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Hirngewebe der Maus mittels Rasterkraftmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Canovic, E. P., et al. Charakterisierung der mehrskaligen mechanischen Eigenschaften von Hirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Stoßeindringung und Rheometrie. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt den Einsatz der Rasterkraftmikroskopie (AFM) zur Messung der viskoelastischen Eigenschaften von Hirngewebe, bei dem ein Cantilever-Sensor mit einer kugelförmigen Sonde mit dem Gewebe interagiert und sich unter den ausgeübten Kräften biegt. Ein Laserstrahl, der auf einen Detektor abgelenkt wird, verfolgt den Cantilever, um die Eindringtiefe und die Kraftrelaxation zu messen und so die mechanischen Eigenschaften des Gewebes zu charakterisieren.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Rasterkraftmikroskop (AFM)-fähige Vertiefung

1. Bereiten Sie Petrischalen (P60) mit einem Durchmesser von 60 mm mit einem aus Muscheln gewonnenen Bioklebstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
   1. Bereiten Sie einen Vorrat an neutraler Pufferlösung vor, der aus 0,1 M Natriumbicarbonat in sterilem Wasser mit einem optimalen pH-Wert von 8,0 besteht. Den Natriumbicarbonatpuffer filtrieren (0,2 Mikrometer) und bei 4 °C lagern.
   2. In einer Laminar-Flow-Haube wird eine Lösung aus 6,25 % aus Muscheln gewonnenem Bioklebstoff und 3,125 % Natriumhydroxid (NaOH) mit dem Natriumbicarbonatpuffer gemischt.
   3. Pipettieren Sie 100 μl der Bioadhäsivlösung in eine Petrischalen (P60) mit einem Durchmesser von 60 mm und verteilen Sie die Lösung mit einer Pipettenspitze in einem Kreis mit einem Durchmesser von 3-5 cm.
   4. Lassen Sie das P60-Geschirr unbedeckt in einer Laminar-Flow-Haube und lassen Sie die Lösung trocknen (~30 min). Spülen Sie das Geschirr 1x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 2x mit sterilem Wasser. Lassen Sie das Geschirr in einer Laminar-Flow-Dunstabzugshaube an der Luft trocknen und bewahren Sie es in einer verschlossenen Plastiktüte bei 4 °C bis zu 1 Monat auf.
2. Kalibrieren Sie das AFM und richten Sie eine Gehirnprobe im AFM ein. HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen zur AFM-Kalibrierung gemäß Hersteller.
   1. Legen Sie vorsichtig eine AFM-Sonde mit einer nominalen Federkonstante von 0,03 N/m und eine Borosilikatkugel mit einem Durchmesser von 20 μm in den Sondenhalter ein.
   2. Kalibrieren Sie die Federkonstante und die inverse optische Hebelempfindlichkeit (InvOLS) des AFM-Auslegers mit der thermischen Abstimmungsmethode.
      HINWEIS: Sobald die Federkonstante für eine AFM-Sonde berechnet wurde, sollte sie bei wiederholter Verwendung konstant bleiben. Der Cantilever-InvOLS muss jedoch jedes Mal neu kalibriert werden, wenn der Laser mit dem Ausleger neu ausgerichtet wird. Darüber hinaus sollte die Kalibrierung gegen ein Substrat durchgeführt werden, das um mehrere Größenordnungen steifer ist als der Ausleger, wie z. B. Polystyrol.
   3. Schalten Sie die auf der Bühne montierte Heizung ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
   4. Montieren Sie die Gehirnscheibe auf die P60-Schalen.
      1. Eine 350 μm dicke Hirnscheibe und das Kohlendioxid (CO₂)-unabhängige Medium aus dem Rundkolben werden vorsichtig in eine P60-Schale gegossen, die mit dem aus Muscheln gewonnenen Bioklebstoff beschichtet ist.
      2. Positionieren Sie die Gehirnscheibe in der Mitte der P60-Schale, indem Sie sie leicht kippen. Falls nötig, pipettieren Sie das Medium langsam mit einer manuellen Pipette, um eine Gehirnscheibe zu entfalten, die sich auf sich selbst gefaltet hat, oder noch besser, positionieren Sie die Gehirnscheibe in der Mitte der Schale.
      3. Entfernen Sie überschüssige Medien vorsichtig mit einer P1000-Pipette (verwenden Sie nicht das Vakuum).
      4. Setzen Sie eine Abdeckung auf die P60-Schale und lassen Sie die Gehirnscheibe 20 Minuten lang haften.
   5. Entfernen Sie den AFM-Kopf, platzieren Sie die in der P60-Schale montierte Gehirnscheibe auf dem AFM-Tisch und fügen Sie ~2 ml vorgewärmtes CO₂-unabhängiges Medium hinzu.
   6. Geben Sie vorsichtig einen Tropfen Medium auf die AFM-Sonde, um sie vor Bruch durch Oberflächenspannung zu schützen, wenn sie in das Medium abgesenkt wird, das die Gehirnscheibe umgibt.
   7. Positionieren Sie den AFM-Kopf wieder auf der Bühne und beginnen Sie, den Kopf abzusenken, bis er in das Medium eingetaucht ist.
   8. Positionieren Sie den Laser mit der CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) von oben wieder auf dem Ausleger.
      HINWEIS: Die Ausrichtung des Lasers auf dem Ausleger hat sich aufgrund des unterschiedlichen Brechungsindex von Luft und Medium leicht geändert.
   9. Warten Sie 5 Minuten, bis sich der Cantilever an das Eintauchen in eine warme Flüssigkeit gewöhnt hat, und stellen Sie dann die Spiegelausrichtung auf eine freie Auslenkung von 0 V ein.
   10. Führen Sie ein thermisches Spektrum auf der AFM-Sonde gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Verwenden Sie die Anpassung des ersten thermischen Peaks, um das InvOLS der AFM-Sonde in Medien neu zu berechnen.
   11. Bewegen Sie den Probentisch mit dem optischen Mikroskop so, dass sich die interessierende Gehirnregion unter der AFM-Sonde befindet. HINWEIS: Das Corpus callosum erscheint dunkel, da es undurchsichtiger ist als die umgebende graue Substanz. Die Hirnrinde ist dem Corpus callosum übergeordnet.
   12. Setzen Sie die Spiegelausrichtung auf eine freie Auslenkung von 0 V zurück.
   13. Klicken Sie auf dem Summen- und Ablenkungsmesser in der AFM-Software auf "Einrasten", um den AFM-Kopf einzurasten.
   14. Senken Sie den Kopf mit dem Positionsregler am AFM-Kopf ab, bis der Cantilever-Sensor und die Probe in Kontakt kommen.
3. Durchführung von Kriechkonformitätsexperimenten.
   1. Konstruieren Sie eine Funktion für aufgebrachte Kraft im Funktionseditor der Software. Die Kraftfunktion besteht aus einer 0,1-Sekunden-Rampe auf einen Sollwert von 5 nN und einer 20-Sekunden-Haltung, gefolgt von einer 1-Sekunden-Rampe auf eine aufgebrachte Kraft von 0 nN.
      1. Wählen Sie im Einrückungs-Master-Panel unter der Einrückungsmethode "Laden" für den Einrückungsmodus, "N" für Einheiten und "Funktionseditor" für Einrückungsfunktion.
      2. Erstellen Sie im Funktionseditor in der Gruppe Segment-Parms ein Segment der aufgebrachten Kraftfunktion, das bei 0 nN beginnt und bei 5 nN endet, mit einer Zeit von 0,1 Sekunden. Klicken Sie auf "Einfügen -->".
      3. Für das nächste Segment setzen Sie den Start auf 5 nN, das Ende auf 5 nN und die Zeit auf 20 Sekunden. Klicken Sie auf "Einfügen -->".
      4. Legen Sie für das letzte Segment den Start auf 5 nN, das Ende auf 0 nN und die Zeit auf 1 Sekunde fest. Klicken Sie dann auf "Zeichnen" und schließen Sie das Fenster des Funktionseditors.
   2. Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Kraft" des Master-Panels die Option "Eindringrampe nach dem Trigger" und stellen Sie die Funktion "Angewendete Kraft" so ein, dass sie nach Erreichen eines Auslösepunkts von 0,1 V ausgelöst wird.
   3. Klicken Sie auf "Einzelne Kraft" am unteren Rand der Registerkarte "Kraft" des Master-Panels, wodurch die Funktion "Konstruiert-aufgebrachte Kraft" für die Einhaltung des Kriechens ausgelöst wird.
   4. Nachdem die Einkerbung mit einer einzigen Kraft abgeschlossen ist, heben Sie den AFM-Kopf so an, dass er keinen Kontakt mit der Probe hat. Rasten Sie dann den Kopf wieder ein und stellen Sie die freie Auslenkung wieder auf Null.
   5. Positionieren Sie den Probentisch neu, um einen neuen Interessenbereich zu lokalisieren, und senken Sie den AFM-Kopf ab, um den Kontakt herzustellen. HINWEIS: Der AFM-Kopf muss von der Probenoberfläche zurückgezogen werden, wenn der Probentisch bewegt wird. Andernfalls kann der empfindliche AFM-Ausleger beschädigt werden.
   6. Wiederholen Sie die Schritte, bis die gewünschte Datenmenge erfasst wurde.
4. Führen Sie Kraftrelaxationsexperimente durch.
   1. Erstellen Sie eine angewendete Einrückungsfunktion im Funktionseditor der Software. Die Eindringfunktion besteht aus einer 0,1-Sekunden-Rampe auf einen Sollwert von 3 μm und einer 20-Sekunden-Haltung, gefolgt von einer 1-Sekunden-Rampe bis zu einer Eindringtiefe von 0 μm.
      1. Wählen Sie auf dem Eindringmaster-Panel unter der Eindringmethode "Einrückung" für den Eindringmodus aus. "m" für Einheiten und "Funktionseditor" für Eindringkörperfunktion.
      2. Erstellen Sie im Funktionseditor in der Gruppe Segment-Parms ein Segment der aufgebrachten Kraft, das bei 0 μm beginnt und bei 3 μm endet, mit einer Zeit von 0,1 Sekunden. Klicken Sie auf "Einfügen -->".
      3. Stellen Sie für das nächste Segment den Start auf 3 μm, das Ende auf 3 μm und die Zeit auf 20 Sekunden ein. Klicken Sie auf "Einfügen -->".
      4. Legen Sie für das letzte Segment den Start auf 3 μm, das Ende auf 0 μm und die Zeit auf 1 Sekunde fest. Klicken Sie dann auf "Zeichnen" und schließen Sie das Fenster des Funktionseditors.
   2. Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Kraft" des Master-Panels die Option "Eindringrampe nach dem Trigger" und stellen Sie die Funktion "Angewendete Kraft" so ein, dass sie nach Erreichen eines Auslösepunkts von 0,1 V ausgelöst wird.
   3. Klicken Sie auf "Einzelne Kraft" am unteren Rand der Registerkarte "Kraft" des Master-Panels, um die konstruiert angewendete Eindringfunktion für die Kraftrelaxation auszulösen.
   4. Nachdem die Einkerbung mit einer einzigen Kraft abgeschlossen ist, heben Sie den AFM-Kopf so an, dass er keinen Kontakt mit der Probe hat, rasten Sie dann wieder ein und stellen Sie die Auslenkung wieder auf Null.
   5. Positionieren Sie den Tisch neu, um einen neuen Interessenbereich zu lokalisieren, und senken Sie den Kopf, um den Kontakt herzustellen.
   6. Wiederholen Sie beide Messungen, bis die gewünschte Datenmenge erfasst wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hibernate-A Medium	Gibco	A1247501	CO2-unabhängiges neuronales Medium für adultes Gewebe
Rasterkraftmikroskop, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Petrischalenheizung	Asylum Research	-
AFM-Sonde, 0,03 N/m, Borosilikatkugel mit 10 μm Radius	Novascan	PT.
Cell-Tak	Corning	354240	Bioklebstoff aus Muscheln
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761	Alternative Lieferanten können verwendet werden
Natriumhydroxid, 1N	Sigma-Aldrich	59223C	Alternative Lieferanten können verwendet werden

GS