Messung der viskoelastischen Eigenschaften von Hirngewebe von Mäusen mittels Rheometrie

Abstract

Quelle: Canovic, E. P., et al. Charakterisierung der mehrskaligen mechanischen Eigenschaften von Hirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Stoßeindringung und Rheometrie. J. Vis. Exp. (2016)

In diesem Video wurde ein Rheometer verwendet, um eine kontrollierte oszillatorische Rotationsbewegung auf das Gehirngewebe anzuwenden, um eine Scherdehnung zu erzeugen und die viskosen und elastischen Eigenschaften des Gewebes zu bewerten. Das Rheometer als funktionelles Werkzeug ermöglicht Einblicke in die Gehirnmechanik bei Verletzungen oder neurodegenerativen Erkrankungen.

Protocol

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Rheologie
   1. Richten Sie das Rheometer gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kalibrieren Sie es.
      1. Initialisieren Sie das Rheometer, indem Sie das Gerät/Bedienfeld öffnen. Klicken Sie auf der Registerkarte "Systemsteuerung" auf "Initialisieren".
      2. Montieren Sie die Messplatte mit einem Durchmesser von 25 mm (PP25) und das thermische System.
      3. (Fakultativ) Um den Schlupf zwischen den Rheometerplatten und dem Gewebe zu verringern, schneiden Sie selbstklebende Schleifpapierscheiben aus, die der Form der oberen Rheometerplatte entsprechen, und kleben Sie das Schleifpapier auf die obere und untere Platte.
      4. Stellen Sie Kontakt zwischen der oberen und unteren Platte her, indem Sie auf dem Bedienfeld auf "Nullspalt einstellen" klicken.
      5. Stellen Sie den Normalkraftaufnehmer auf Null, indem Sie auf "Normalkraft zurücksetzen" klicken.
      6. Führen Sie einen Trägheitstest durch, indem Sie die Registerkarte "Service" auf dem Bedienfeld öffnen, auf "Messsystem" und dann auf "Trägheitstest" klicken. Erfassen Sie die alte und neue Trägheit. Stellen Sie sicher, dass die Trägheit innerhalb des vom Hersteller angegebenen zulässigen Grenzwerts für die Sonde liegt.
2. Laden Sie die Probe in das Rheometer.
   1. Nachdem Sie das Gewebe entnommen und ein koronales Segment des Schweinehirns auf ~5 mm Dicke geschnitten haben, lagern Sie es auf Eis in einem CO2-unabhängigen Medium.
   2. Platzieren Sie das Gehirn zwischen den beiden Platten. Entfernen Sie große Wassertropfen von der Ober- und Unterseite der Probe, um ein Verrutschen zu verhindern, aber trocknen Sie die Probe nicht aus.
   3. Senken Sie die Messplatte langsam ab, bis die Platte vollen Kontakt mit der oberen Oberfläche des Gewebes hat und die gemessene Normalkraft nach einer Entspannungsphase von 5-10 Minuten konstant bei 0,01 mN liegt.
      1. Geben Sie im Bedienfeld in das Feld Messposition sukzessive Absenkungen ein und klicken Sie auf "Messposition", um die Messplatte langsam abzusenken.
      2. Wenn Sie innerhalb eines Millimeters Kontakt mit dem Gewebe haben, senken Sie die Messplatte in Schritten von 0,1 mm ab, bis die Platte vollständig mit der Oberseite des Gewebes in Kontakt kommt. Stellen Sie sicher, dass die gemessene Normalkraft nach einer Relaxationsphase von 5-10 Minuten konstant bei 0,01 mN liegt.
      3. Notieren Sie die anfänglich gemessene Normalkraft. Wiederholte Messungen sollten bei den gleichen Druckspannungen/Dehnungen durchgeführt werden.
   4. Wenn die Probe den Durchmesser der Platte überschreitet, schneiden Sie sie mit einer Kunststoffklinge ab. Pipettieren Sie ein kleines Volumen (~1-2 ml) des Mediums an den Rändern der Probe, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen.
   5. (Fakultativ) Senken Sie die Thermohaube ab. Stellen Sie auf dem Bedienfeld die Temperatur auf 37 °C ein und klicken Sie auf "Einstellen".
3. Führen Sie einen Amplitudensweep durch, um den linearen viskoelastischen Bereich des Materials zu ermitteln (d.h. die Scherdehnungen, bei denen G' und G'' konstant sind) bei interessierenden Frequenzen (z. B. 1 rad/sec).
   1. Wählen Sie "Datei/Neu". Wählen Sie auf der Registerkarte "Gel" die Option "Amplituden-Sweep: LVE-Bereich". Wählen Sie das Fenster aus und klicken Sie auf "Messung 1: Amplituden-Sweep". Doppelklicken Sie auf das Oszillationsfeld. Geben Sie die Anfangs- und Enddehnung (, z. B. 0,01 bis 105), die Frequenz (, z. B. 1 rad/sec) und die Anzahl der Punkte pro Dekade (, z. B. 6 Punkte/Dez.) ein. Wählen Sie "OK" und klicken Sie auf "Start".
   2. Wiederholen Sie diesen Vorgang für mehrere Schichten mit wiederholten Versuchen, um die Konsistenz des linearen Elastizitätsbereichs sicherzustellen. Die axiale Kompression der Probe sollte zwischen den Proben konstant bleiben.
4. Führen Sie einen Frequenz-Sweep des Gewebes bei einer Dehnung im linearen viskoelastischen Bereich des Gewebes (, z. B. 1 % Dehnung) und bei einem interessierenden Frequenzbereich (, z. B. , 0,1-100 rad/sec) durch.
   1. Klicken Sie auf "Datei/Neu" und wählen Sie unter dem Gel-Tab "Frequenz-Sweep". Klicken Sie auf Fenster/Messung 1: Frequenz-Sweep. Doppelklicken Sie auf das Oszillationsfeld. Geben Sie den Frequenzbereich (, z. B. , 0,1 bis 100 rad/sec), die Dehnung (, z. B. , 1% Dehnung) und die Anzahl der Punkte pro Dekade (, z. B. , 6 Punkte/Dek) ein. Wählen Sie "ok" und klicken Sie auf "Start", um den Frequenzdurchlauf zu starten.
5. Wiederholen Sie den Frequency Sweep (Schritt 1.4) in Duplikaten oder Triplikaten.

Überprüfen Sie die Daten, die vom Rheometer automatisch berechnet und exportiert werden: G' und G" als Funktion der Frequenz (Frequenzdurchlauf) oder der Scherdehnung (Amplitudendurchlauf). HINWEIS: G' und G'' werden aus der (maximalen) Reaktionsdrehmomentamplitude T'0 und dem Drehverschiebungswinkel (oder Ablenkwinkel) φ° und dem Phasenabstand φ der Reaktion der Probe auf die angelegte Schwingdehnung berechnet (Abbildung 1):

wobei R und h der Radius und die Höhe der Probe sind.

Results

Abbildung 1. Illustration von Experimenten mit parallelen Plattenrheometern. (A) Schematische Darstellung des Experiments mit parallelen Plattenrheometern und Definitionen in Bezug auf die angewendete oszillatorische Scherdehnung. (B) Repräse...

Materials