Laserablations-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie zur Visualisierung von Metallen im Hirngewebe von Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Hare, D. J., et.al. Bildgebung von Metallen im Hirngewebe durch Laserablation - Induktiv gekoppeltes Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die Verwendung der Laserablations-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA-ICP-MS) zur Visualisierung und Quantifizierung von Metallverteilungen im Hirngewebe von Mäusen. Das Protokoll umfasst die Laserablation zur Erzeugung eines Aerosols aus Probenpartikeln, die Ionisierung der Partikel in Hochtemperaturplasma und die Massenspektrometrie zur Trennung der Ionen nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis. Mit einer speziellen Software werden dann quantitative Bilder erstellt, die die räumliche Verteilung der Metalle im Gewebe aufzeigen.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tierproben verwendet werden, wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung des LA-ICP-MS für die Analyse

1. Platzieren Sie die Standards und die Probe in der Ablationskammer und stellen Sie sicher, dass sie sich innerhalb der Schärfentiefe der CCD-Kamera befinden, die an der LA-Einheit angebracht ist. Wenn ein Stimmen des Instruments erforderlich ist, fügen Sie ein geeignetes Referenzmaterial hinzu (, z. B. NIST 612 Trace Elements in Glass). Ziehen Sie die beiden Schrauben an der Kammertür mit den Fingern fest, um die Ablationskammer abzudichten.
2. Wählen Sie in der ICP-MS-Software im Bereich "Wartung" oder einem ähnlichen Panel die Option "Argongasventil öffnen" und stellen Sie den Trägergasfluss im entsprechenden Dialogfeld auf 1,2 L min^-1 ein.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wird Argon als Trägergas verwendet. In mehreren Beispielen wird entweder Helium oder ein Gemisch aus Helium und Argon als Trägergas verwendet.
3. Klicken Sie in der LA-Software auf die Schaltfläche "Spülen", um die Zelle mindestens 30 Minuten lang mit Argongas zu spülen.
   HINWEIS: Die Spülzeit kann durch Klicken auf eine Schaltfläche "Spülzeit" oder eine ähnliche Schaltfläche geändert werden. Wenn Sie ein Ablationssystem mit einer Ablationszelle mit zwei Volumen verwenden, bewegen Sie den Tisch regelmäßig in jede Ecke und durchqueren Sie die Zelle diagonal, um sicherzustellen, dass so viel Restluft wie möglich aus der Zelle entfernt wird. Dies kann durch Auswahl der "Home Stages" oder einer gleichwertigen Funktion erreicht werden.
4. Schalten Sie das ICP-MS ein, indem Sie auf "Plasma an" klicken, und lassen Sie es zwei Stunden lang aufwärmen, während derer die Schritte 1.5 - 2.4 ausgeführt werden können. Die Geräteeinstellungen variieren je nach Hersteller.
5. Repräsentative Ablation von Gewebestandards
   1. Wählen Sie das Linienwerkzeug aus und ziehen Sie eine einzelne Ablationslinie von ca. 3 mm Länge über die Gewebeoberfläche.
   2. Stellen Sie die Parameter wie folgt ein, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Ablationslinie in der Experimentliste klicken und Folgendes ändern: Strahldurchmesser (vom Benutzer entsprechend ausgewählt; hier wird ein 30 μm quadratischer Strahl verwendet), Scangeschwindigkeit (4-facher Strahldurchmesser pro Sekunde; 120 μm s^-1) und Energiefluenz (0,3 -0,5 J cm^-2 für Weichgewebe; ggf. optimieren für härtere Matrices). Bei einer Gewebedicke von 30 μm durchdringt der Laserstrahl nicht die volle Dicke dieses Gewebes, wodurch potenzielle Verunreinigungen aus der Mikroskophalterung eliminiert werden. Die Normalisierung auf Kohlenstoff kann verwendet werden, um Schwankungen in der Menge des abgetragenen Gewebes auszugleichen. Legen Sie diese Parameter als Standard für jede nachfolgende Zeile fest, indem Sie das Optionsfeld 'default' auswählen.
   3. Duplizieren Sie diese Zeile sechsmal, indem Sie die Anfangszeile auswählen, mit der rechten Maustaste klicken und "Scans duplizieren" auswählen. Stellen Sie sicher, dass die Linien entweder in der Achse x- oder y- um den Balkendurchmesser versetzt sind. Dies ergibt insgesamt sieben Linien pro Norm, die entsprechend dem Strahldurchmesser voneinander beabstandet sind.
   4. Die Schritte 1.5.1 - 1.5.3 für jede Norm wiederholen und dabei darauf achten, dass die Linie identisch ist.
6. Um den Ablationsbereich über die Probe zu zeichnen, befolgen Sie eine der beiden folgenden Methoden:
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die gleichen Scanparameter (Strahldurchmesser, Scangeschwindigkeit, Energiefluenz) für Probenlinien verwendet werden.
   1. Wenn das LA-System mit einem weiten Sichtfeld ausgestattet ist, wählen Sie das Linienwerkzeug aus und zeichnen Sie eine Linie aus der oberen linken Ecke der Probe, die lang genug ist, um die Probe an ihrer breitesten Stelle abzudecken, und zwar mit den gleichen Laserparametern wie in 1.5. Dieser Scan ist wie in Abschnitt 1.5.3 beschrieben zu duplizieren, wobei die Linien entsprechend dem Strahldurchmesser so oft wie nötig angeordnet sind, um eine vollständige Abdeckung der Probe zu gewährleisten.
   2. Wenn keine Weitwinkelansicht verfügbar ist, bestimmen und notieren Sie die Koordinaten x und y (die auf dem Hauptbildschirm normalerweise als "Tischposition" oder ähnliches angezeigt werden), die den Ecken eines Rechtecks entsprechen, das die gesamte Probe abdeckt. Verwenden Sie diese Koordinaten, um parallele Ablationslinien zu positionieren, die den gesamten Probenbereich abdecken.
   3. Ziehen Sie Linien für das intermittierende Scannen von Standards spätestens nach ~20 h Scannen der Probe, indem Sie den in 1.5 beschriebenen Vorgang wiederholen. Abhängig von der Scandauer der Probe kann dies mehrmals erforderlich sein. Beenden Sie das Experiment mit einem zusätzlichen Scan der Standards.
      HINWEIS: Bei der Bestimmung der Koordinaten x und y während der Bereinigung der Zelle ändert die Auswahl der Ausgangspositionen und die zugehörige Kalibrierung der Achse die zuvor erfassten Spezifika für die Koordinaten x und y, wobei die Differenz (d.h. die Länge der Linie) nicht beeinflusst wird.

2. Einrichten von Datenerfassungsmethoden für die ICP-MS

1. Für die Standardablationslinie dividieren Sie die Länge der Linie durch die Laserscangeschwindigkeit, um die Gesamtanalysezeit für eine einzelne Linie zu bestimmen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Probenlinie.
2. Erstellen Sie in der ICP-MS-Software eine neue Methode (hier als "Batch" dargestellt) und stellen Sie sicher, dass "zeitaufgelöste Analyse" oder eine gleichwertige Methode ausgewählt ist. Wählen Sie die zu erkennenden m/z-Werte aus und passen Sie dann die Integrationszeit für jeden m/z so an, dass die Gesamtintegrationszeit für einen Zyklus 0,25 s beträgt. Klicken Sie auf "Batch speichern unter" und benennen Sie entsprechend (, z. B. Std1).
   HINWEIS: Da die Probe den Laserstrahl mit dem vierfachen Strahldurchmesser durchläuft, wird sichergestellt, dass für jede Masse ein Datenpunkt aufgezeichnet wird, der dem Strahldurchmesser entspricht. Bei einer Punktgröße von 100 μm erzeugt beispielsweise eine Scangeschwindigkeit von 400 μm s^-1 bei einer Integrationszeit von 0,25 s Bilder mit echten Pixelgrößen. Die Integrationszeit kann angepasst werden, um die Empfindlichkeit zu verbessern. Wenn die Integrationszeit auf 0,33 s erhöht wird, sollte die Scangeschwindigkeit auf das Dreifache des Strahldurchmessers verlangsamt werden.
3. Geben Sie bei Standards die Analysezeit für jeden Zeilenscan in das entsprechende Feld ein, zuzüglich zusätzlicher 15 s zur Berücksichtigung der Aufwärm- und Auswaschzeiten des Lasers. Geben Sie eine Beispiellaufliste (d.h. die Reihenfolge, in der Scans ausgeführt werden) mit der gleichen Anzahl von Erfassungen ein (typischerweise fortlaufend nummeriert; d.h. 01, 002, etc.) als Gesamtzahl der Normzeilen.
4. Duplizieren Sie für das Beispiel die für die Standards verwendete Methode, indem Sie die aktuelle Methode oder den aktuellen Stapel mit einem alternativen Dateinamen speichern, und passen Sie die Gesamterfassungszeit (einschließlich der zusätzlichen 15 s) und die Gesamtzahl der Erfassungen an die Anzahl der Zeilen an, die das Muster abtragen.
   HINWEIS: Da die meisten LA-ICP-MS-Systeme einen unidirektionalen Trigger verwenden (LA löst ICP-MS aus), ist es wichtig, dass die ICP-MS-Software auf den Trigger vom LA wartet, bevor die nachfolgende Ablationslinie beginnt. Im ICP-MS-Erfassungsfenster wird "Warten auf Start" angezeigt.

3. Ausführen des Experiments

1. Starten Sie die ICP-MS-Warteschlange, indem Sie der Warteschlange die erste Methode oder den ersten Batch hinzufügen, und stellen Sie sicher, dass die Software auf den Auslöser vom LA-System wartet.
2. Aktivieren Sie in der LA-Software die Laserstromversorgung, indem Sie auf "Emission" klicken, klicken Sie auf "Run" und stellen Sie die Aufwärmzeit des Lasers auf 10 s und die Auswaschzeit auf 20 s in den entsprechenden Feldern ein.
   HINWEIS: Dieser Nachlauf stellt sicher, dass das ICP-MS bereit ist, mit der Erfassung neuer Daten zu beginnen, wenn der Laser mit jeder nachfolgenden Ablationslinie beginnt.
3. Starten Sie die Lasersequenz, indem Sie auf "Start" klicken. Wenn Sie eine Zelle mit zwei Volumina verwenden, stellen Sie sicher, dass der Probenbecher in Position ist.

4. Berechnung von Quantifizierungsstandards

HINWEIS: Es gibt mehrere Varianten für die Umwandlung von ICP-MS-Daten in Bilder. Dazu gehören die Verwendung von selbstgemachten Software-Tools, die in Open-Source-Sprachen geschrieben sind, kommerzielle Makros und Datenanalysesoftware. Verwenden Sie hier das kürzlich entwickelte Software-Plugin, das auf einer spezialisierten LA-ICP-MS-Datenanalyse-Suite basiert.

1. Übertragen Sie alle Batch-Ordner mit den Laufdaten (001.d, 002.d, etc.) auf einen separaten Computer, auf dem die Analysesoftware installiert ist. Extrahieren Sie die *.csv-Datendateien für jede Zeile des Stapels in einen separaten Ordner.
   HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, ein Skript zum automatischen Übertragen von *.csv-Dateien in einen neuen Ordner zu verwenden. Weitere Informationen finden Sie im angehängten Python-Code. Dieses Skript wurde für ein ICP-MS der Agilent 7700- oder 8800-Serie geschrieben, kann aber auch an die Ausgabedatei anderer Hersteller angepasst werden.
2. Öffnen Sie die Softwareplattform und folgen Sie den Registerkarten nacheinander, um die Standards zu importieren und zu analysieren und quantitative Bilder zu erstellen, wie unten beschrieben.
3. Um die Daten aus dem ersten Standardstapel zu importieren, wählen Sie "Agilent .csv" für "Dateityp", "Gesamter Ordner" für "Importtyp" und überprüfen Sie, ob das "Datumsformat" mit dem Computerformat identisch ist. Klicken Sie auf 'Importieren', wählen Sie den Ordner aus, der die .csv-Dateien für den ersten Satz von Standards enthält, und wechseln Sie zur Registerkarte 'Baselines'.
4. Basissubtraktion
   1. Verwenden Sie die Registerkarte 'Automatische Auswahl' (Befehl 2) aus dem Dropdown-Menü der Hauptanwendung in der Symbolleiste, wählen Sie 'Informationen aus Import' und klicken Sie auf 'Weiter'.
   2. Klicken Sie auf "Alle auswählen" und wählen Sie "Baseline_1" für die Integration.
   3. Um die ersten 10 s jeder Scanzeile auszuwählen (entsprechend der Aufwärmzeit des Lasers), schneiden Sie die Daten zu, indem Sie die zweiten Werte '0' und '(Dauer der Zeile - 10 s)' eingeben und klicken Sie auf 'Integrationen hinzufügen' (z. B. für eine 35 s Scanzeile, geben Sie die Werte '0' und '25' ein).
5. Um die Beispieldaten auszuwählen, verwenden Sie die Registerkarte "Automatische Auswahl", wie in 4.4 beschrieben, wählen Sie jedoch "Output_1" als Integration. Beschneiden Sie die Daten vom Anfang und Ende jeder Normzeile, um das Hintergrundsignal auszuschließen (z.B. für eine 35-s-Scanzeile, geben Sie die Werte '13' und '4' ein).
6. Um Signaleinbrüche auszuschließen, die durch mögliche Lücken in den Standards verursacht werden, klicken Sie auf der Registerkarte "Samples" oben links im Diagrammbereich auf "Kanäle", um einen Kanal mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis auszuwählen (, z. B. C13 oder P31). Notieren Sie sich alle starken Abfall im Signal und wählen Sie einen CPS-Wert, der niedrig genug ist, um unter der normalen Variation innerhalb der Samples zu liegen, aber hoch genug, um die starken Abfallfälle im Signal zu erkennen.
7. Klicken Sie auf die Registerkarte "DRS" und wählen Sie "Baseline_Subtract" für das "Schema zur aktuellen Datenreduzierung". Wählen Sie den Kanal aus 4.6 für 'Index Channel' und den CPS-Wert für 'Threshold to use when masking lows signals'. Geben Sie einen Wert <0,5 s für "Sekunden zum Trimmen vor/nach niedrigen Signalen" ein, um die Verzögerung bei der Signalübertragung vom Laser zum ICP-MS zu berücksichtigen.
8. Um eine adäquate Maskierung der tiefen Signalbereiche zu bestätigen, klicken Sie zurück zum Reiter 'Samples' und wählen Sie eine bearbeitete (z.B., Fe56_CPS) Kanalspur aus. Wiederholen und verfeinern Sie bei Bedarf die Werte CPS und 'Seconds to trim before/after low signals' wie in 4.7.
9. Klicken Sie auf die Registerkarte "Ergebnisse" und wählen Sie "Daten exportieren" aus dem Dropdown-Menü der Hauptanwendung. Geben Sie einen Dateinamen ein, um eine Tabellenkalkulationsdatendatei mit den Ergebnissen zu generieren (, z. B. Std1-Berechnungen, Std2...).
10. Öffnen Sie die Datendatei in einem geeigneten Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie die CPS-Werte für jeden einzelnen Kanal, der quantifiziert werden soll. Verwenden Sie die vorgegebenen Metallkonzentrationen aus der Lösungsvernebelung ICP-MS, um den Umrechnungsfaktor aus CPS-Werten in ppm (μg g⁻¹) für jedes quantifizierbare Element zu berechnen.
11. Wiederholen Sie die Schritte 4.3 - 4.10 für alle Normsätze im Lauf.

5. Erstellen von quantitativen Bildern

1. Geben Sie 'Biolite()' in die Eingabeaufforderung ein, um die Software zu öffnen.
2. Importieren Sie die Beispieldaten, indem Sie auf "Bilder laden" klicken und den Ordner auswählen, der die .csv-Dateien für das Beispielbild enthält.
3. Hintergrundkorrektur
   1. Klicken Sie auf die Registerkarte "Baselines", um die Hintergrundkorrektur für das Beispiel anzuwenden. Wählen Sie auf dem Phosphorbild (P31), das auf dem Bildschirm angezeigt wird, mit dem Rechteckzeichen-Werkzeug Bereiche des Hintergrunds aus. Durch die Auswahl so vieler Bereiche wie möglich wird eine bildweite Karte der Signal-/Plasmadrift erstellt, um eine angemessene Kompensation dieser Störfaktoren zu gewährleisten.
   2. Um das Hintergrundsignal besser sichtbar zu machen, wählen Sie das Diagrammbearbeitungswerkzeug (oben links im angezeigten Bild) aus und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild. Wählen Sie 'Bilddarstellung ändern' und ändern Sie die 'Erste Farbe bei Z=' in einen großen negativen Wert (, z.B. -100.000). Fahren Sie fort, indem Sie auf "Fertig" klicken.
4. Klicken Sie auf die Registerkarte "Standards", um eine Tabelle mit CPS/ppm-Korrekturfaktoren aufzurufen. Geben Sie für jedes Element die aus den Normen in Schritt 4.10 berechneten Werte ein. Dieser Schritt hilft dabei, die Empfindlichkeitsdrift im ICP-MS zu korrigieren. Klicken Sie auf "Los!".
5. Öffnen Sie den "Datenbrowser" auf der Registerkarte "Daten", auf der die Bilder für jedes Element und jeden Schritt gespeichert sind.
6. Um ein Bild für den Export fertigzustellen, wählen Sie das gewünschte Bild im Ordner 'StdCorrImages' aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Bildnamen (*_ppm) und klicken Sie auf 'NeuBild'. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild, um "Bilddarstellung ändern" zu öffnen und eine gewünschte Farbtabelle und Farbskala auszuwählen. Fügen Sie dem Bild eine Farbskala hinzu, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken und "Anmerkung hinzufügen" auswählen. Wählen Sie "Farbskala" aus dem Dropdown-Menü oben links und verwenden Sie die Registerkarten, um die gewünschte Farbskala zu ändern.
7. Um ein Bild zu exportieren, stellen Sie sicher, dass das betreffende Bild ausgewählt ist, navigieren Sie zur Registerkarte "Datei" und klicken Sie auf "Grafiken speichern...". Wählen Sie das gewünschte Format aus und speichern Sie das Bild. Alternativ kann das ausgewählte Bild mit den Werkzeugen Kopieren und Einfügen übertragen werden.
8. Wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7 für alle Bilder, die Sie interessieren.
9. Quantifizierung diskreter Regionen
   1. Um die ROI-Tools zu aktivieren, navigieren Sie zur Registerkarte "Analyse", "Pakete" und wählen Sie "Bildverarbeitung".
   2. Wählen Sie das gewünschte Bild aus, navigieren Sie zur Registerkarte "Bild" und klicken Sie auf "ROI...". Klicken Sie auf "ROI-Zeichnung starten" und verwenden Sie ein Zeichenwerkzeug, um einen Interessenbereich in der Stichprobe auszuwählen. Um die Zeichnung abzuschließen, klicken Sie auf "ROI abschließen".
   3. Um die Statistiken für den ausgewählten ROI zu erhalten, navigieren Sie zur Registerkarte "Bild" und klicken Sie auf "Statistiken...".
   4. Kopieren Sie die Ergebnisse und fügen Sie sie in eine separate Tabelle ein. Wiederholen Sie die ROI-Auswahl (5.9.2) für alle Regionen und Elemente, die Sie interessieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sodaglas-Objektträger	n/a	n/a	Typische Objektträger eignen sich für alle Experimente
NWR213 Laserablationssystem	ESI Ltd	n/a	Wird in diesen Experimenten verwendet. Andere geeignete Hersteller können Änderungen am Protokoll verlangen
Agilent 8800 Series ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	Verwendet in diesen Experimenten. Andere Hersteller eignen sich, können Änderungen am Protokoll verlangen
Iolite	Iolite Software	n/a	Erhältlich ab http://iolite-software.com/. Andere Methoden sind verfügbar, siehe Protokoll
Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	Wave Metrics	n/a	Verfügbar ab https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm