Biolumineszenz-Bildgebung zur Beurteilung des Tumorwachstums in einem organotypischen Maus-Hirnschnitt

Zusammenfassung

Quelle: Ciraku, L., et. al. Ein Ex-vivo-Hirnschnittmodell zur Untersuchung und gezielten Bestimmung des Wachstums von Hirnmetastasen bei Brustkrebs. J. Vis. exp. (2021).

Dieses Video zeigt die Bildgebung von Luciferase-exprimierenden Tumorzellen in einem organotypischen Maushirnschnitt. Luciferin wird dem Medium zugesetzt, und die Platte wird in die Kammer des In-vivo-Bildgebungssystems gelegt. Die Parameter für die Bilderfassung werden angepasst und die Form und Größe des Tumors definiert. Anschließend werden die von den Tumorzellen ausgesendeten Biolumineszenzsignale aufgezeichnet.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

Hinweis: In dieser Studie wurden athyme weibliche Nu/Nu-Mäuse (6-8 Wochen alt) verwendet.

1. Intrakranielle Injektion von Tumorzellen

1. Sterilisieren Sie alle Geräte (Pinzette, Schere, Nahtscher, Handbohrer) unter einem Trockenzyklus eines Autoklaven für bis zu 45 Minuten in Sterilisationsbeuteln, einschließlich eines Sterilisationsindikators. Wenn Operationen an mehreren Tieren durchgeführt werden, sterilisieren Sie die Werkzeuge zwischen den Tieren mit einem beheizten Bead-Sterilisator (bis zu 3x).
2. Anästhesieren Sie die Mäuse gemäß dem Tierpflegeprotokoll der Benutzer (z. B. Isofluran (4 % für die Induktion, 1-2 % Erhaltungstherapie) und verabreichen Sie Analgesie (subkutan, 0,1 ml von 0,1 mg/kg Buprenorphin SR-LAB) vor Beginn der Operation. Sorgen Sie für eine optimale Anästhesietiefe mit einer Zehenklemme.
3. Platzieren Sie die Mäuse in einem stereotaktischen Rahmen und immobilisieren Sie den Kopf mit Standard-Ohrstangen (Abbildung 1A). Tragen Sie dann eine Augensalbe auf die Augen auf.
4. Sterilisieren Sie die Oberfläche des Kopfes durch wiederholte, abwechselnde Anwendung (3x) von Jodtupfern und 70% Ethanol vor dem Einschnitt.
5. Verwenden Sie ein chirurgisches Skalpell, um einen 1 cm breiten Mittellinienschnitt durch die Haut in einem leicht diagonalen Winkel zur imaginären Linie zu machen, die das Gehirn der Maus in zwei symmetrische Hälften teilt, um den Schädel freizulegen. Wische jegliches Blut mit einem Wattestäbchen ab.
6. Lenken Sie die Haut seitlich ab, um die Injektionsstelle freizulegen: 2 mm rechts, 1 mm nach vorne in Bezug auf das Bregma +2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/kaudal (+1RC).
7. Mit einem Bohrer (0,73 mm) den Schädel +2ML, +1RC bis zum Bregma durchdringen und mit leichtem Druck und Drehbewegung ein Loch bohren.
8. Injizieren Sie mit einer Gehirninjektionsspritze 5 μl einer 100.000 MDA-MB-231BR-Zellen (stabil exprimierendes grün fluoreszierendes Protein oder GFP-Luciferase) Lösung/μl in sterile 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), indem Sie die Spritze zunächst 3,5 mm tief in das Gehirn einführen.
9. Lassen Sie die Spritze 2 Minuten einwirken. Ziehen Sie sie etwa 1 mm nach oben und injizieren Sie nach 2 Minuten langsam die erste Hälfte des Volumens.
10. Warten Sie weitere 2 Minuten, bevor Sie den Rest injizieren, und ziehen Sie die Spritze dann 3 Minuten nach der letzten Injektion langsam heraus. Anmerkung: Die langsame Injektion ist empirisch, da das Volumen gut vom Hirngewebe aufgenommen werden kann und nach dem Ziehen der Spritze keine Leckage entsteht, was dazu führen kann, dass Krebszellen außerhalb der vorgesehenen Stelle wachsen.
11. Tragen Sie Knochenwachs auf die Injektionsstelle am Schädel auf und verwenden Sie dann Polypropylennähte, um das Gewebe zu vernähen. Die Mäuse erholen sich innerhalb von 5 Minuten nach Beendigung der Anästhesie.
12. Überwachen Sie ihr Verhalten direkt nach der Operation für etwa 10 Minuten, 3 Stunden später und am folgenden Tag, um festzustellen, ob eine spezielle Behandlung, einschließlich Kochsalzinjektion, weicher Nahrung usw., erforderlich ist, um eine schnelle Genesung zu unterstützen.
13. Überwachen Sie das Tumorwachstum durch Biolumineszenz-Bildgebung auf dem Bildgebungssystem.
    1. Schalten Sie dazu zuerst den Sauerstoff und das Isofluran im Bildgebungssystem ein. Beide können in eine separate Kammer außerhalb der Bildbox verteilt werden.
    2. Schalten Sie dann die Software ein, initialisieren Sie das Instrument und wählen Sie die entsprechende Option zum Visualisieren und Erfassen des gesamten Mauskörpers.
14. Setzen Sie die Mäuse in eine separate Kammer mit Isofluran und sorgen Sie mit einem Zehenkneifen für eine optimale Narkosetiefe. Injizieren Sie den Mäusen intraperitoneal 200 μl 30 mg/ml Luciferin.
15. Übertragen Sie den Magen der Maus in die mit Sauerstoff und Isofluran versorgte Nase der Bildgebungskammer. Verriegeln Sie die Kammer und wählen Sie eine Belichtungszeit von 2 Minuten, um die Bildgebung zu starten.
16. Verwenden Sie das ROI-Tool (Region of Interest) der Software, um das biolumineszierende Signal des Tumors zu quantifizieren.
17. Um die Tumorgröße zu analysieren, wählen Sie das Kreisformwerkzeug aus, um es an die Tumorform und -größe anzupassen. Messen Sie den ROI und melden Sie die Gesamtmesswerte.
18. Lassen Sie ein solides Tumorwachstum für 12-14 Tage (oder bis die Luziferase etwa 7,0 x 10⁶ Einheiten erreicht) (Abbildung 1B), bevor Sie Gehirnschnitte erzeugen. Anmerkung: Eine Erhöhung der Anzahl der zu injizierenden Zellen führt zu einem schnelleren Tumorwachstum. Daher kann die Erzeugung von Hirnschnitten früher als 12 Tage erfolgen. Auf der anderen Seite führt ein größerer Tumor zu mehr GFP+-Scheiben, wenn er 14 Tage lang wachsen lässt. Nach 14 Tagen beginnt sich der Gesundheitszustand der Mäuse rapide zu verschlechtern; Daher sollte die Überwachung der Tiergesundheit auf einmal täglich nach dem 10-Tage-Zeitpunkt ausgeweitet werden, und alle Mäuse, die Anzeichen von Schmerzen und/oder Unwohlsein zeigen, sollten zur Erzeugung der Scheiben verwendet werden.

2. Generieren Sie Gehirnschnitte

HINWEIS: Führen Sie die Schritte nach der Isolierung des Gehirns in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durch. In der Regel ist es möglich, 35-40 einzelne Scheiben mit Tumorzellen (Luciferase-Signal) von einer Maus zu erzeugen, die mit MDA-MB-231BR-Zellen injiziert wurde (Abbildung 1C).

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven. Setzen Sie den Tissue-Slicer in die sterile Laminar-Flow-Haube ein und reinigen Sie alle Werkzeuge und Instrumente mit 70% Ethanol.
2. Nach 12-14 Tagen nach intrakranieller MDA-MB-231BR-Zellinjektion werden die Mäuse gemäß dem Tierpflegeprotokoll des Anwenders, wie in 1.2 beschrieben, anästhesiert. Sorgen Sie für eine optimale Anästhesietiefe mit einer Zehenklemme.
3. Entnehmen Sie ihr Gehirn und legen Sie es schnell (innerhalb von 45 s) in eiskalte (4 °C) Saccharose-künstliche Zerebrospinalflüssigkeit oder Saccharose-ACSF, bestehend aus: 280 mM Saccharose, 5 mM Kaliumchlorid (KCl), 2 mM Magnesiumchlorid (MgCl₂), 1 mM Calciumchlorid (CaCl₂), 20 mM Glukose, 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure oder HEPES, 5 mM Natrium (Na+)-ascorbat, 3 mM Thioharnstoff, 2 mM Na+, 29 mM Pyruvat; pH = 7,3.
4. Schneiden Sie mit einem scharfen, sterilen Skalpell oder einer Rasierklinge von allen Seiten überschüssige Teile des Gehirns ab, die keinen Tumor enthalten, einschließlich des unteren Teils des Gehirns.
5. Bringen Sie die Form des Gehirns auf einen nicht perfekten Würfel, der flach auf dem ACSF-benetzten Filterpapier auf einem 60-mm-Schalendeckel sitzt, um das Schneiden zu erleichtern. Anmerkung: Zusätzliches Gewebe des Gehirns, in dem der Tumor wahrscheinlich nicht gewachsen ist, wird vor dem Schneiden entfernt, um die Erzeugung von meist GFP+-Schnitten zu ermöglichen und eine Form des Gehirns zu schaffen, die auf der Oberfläche des Instruments stabil ist und nicht durch die durch das Schneiden verursachten Vibrationen gestört wird.
6. Legen Sie mehrere Blatt vornasse (mit ACSF) Filterpapierkreise auf die Schneideplattform und legen Sie das blockierte Gewebe darauf.
7. Stellen Sie die Schnittgröße am Instrument auf 2 oder 2,5 Einheiten auf dem mitgelieferten Lineal ein, um das Gewebe in 200-250 μm große Abschnitte zu schneiden. Anmerkung: Scheiben bis zu 350 μm oder bis zu einer Dicke von 100 μm sind realisierbar. Verwenden Sie für Scheiben <200 μm ein Vibratom oder Kompressionstom.
8. Verwenden Sie einen Pinsel (Zobel), um Gehirnschnitte in eine Schale mit Saccharose ACSF zu übertragen, und trennen Sie die Scheiben unter einem Lichtmikroskop mit 27-G-Nadeln.
9. Identifizieren Sie GFP-positive Scheiben unter dem Fluoreszenzmikroskop und übertragen Sie sie in eine neue 60-mm-Schale mit 2-3 ml Adult-Slice-Medium (Neurobasalmedium A, 2 % B12-Supplement, 1 % N2-Supplement, 1 % Glutamin, 0,5 % Glucose, 10 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) mit einer sterilen 1 mL abgebrochenen Pipette (breite Öffnung). Anmerkung: Die Hirnschnitte, die Tumorzellen enthalten, die über die Gehirnoberfläche wachsen (z. B. aufgrund von Leckagen von Injektionszellen usw.), sind ausgeschlossen.
10. Übertragen Sie 3-5 Scheiben auf je 30 mm, 0,4 μm porengroßen Gewebekultureinsatz in 6-Well-Platten in einem Abstand, der kein Ineinanderwachsen zulässt.
11. Entfernen Sie das überschüssige Medium mit einer P1000-Pipette von der Oberfläche des Einsatzes, fügen Sie 1 ml Medium für adulte Mausscheiben unter jeden Einsatz hinzu und äquilibrieren Sie das Medium vor dem Schneiden im Inkubator.
12. Inkubieren Sie das Gewebe vor der Bildgebung 24 Stunden lang bei 37 °C, 5 % CO_{2 und} 95 % Luftfeuchtigkeit.

3. In-vivo-Bildgebung von Schichten durch das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS)

HINWEIS: Führen Sie die Schritte der Luciferase- und Inhibitorzugabe in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durch.

1. Pipettieren Sie 5 μl 30 mg/ml Luciferinlösung in das Medium unter den Einsätzen, indem Sie den Einsatz mit einer Pinzette anheben und nach Zugabe von Luciferin zu den Medien in der Vertiefung wieder in die Vertiefung einsetzen.
2. Platzieren Sie die 6-Well-Platte mit dem Deckel in der Bildgebungskammer des Instruments unter der stationären Kamera und verriegeln Sie die Kammertür.
3. Öffnen Sie die Software und initialisieren Sie das Gerät.
4. Wählen Sie Kameraeinstellungen, die die Visualisierung und Erfassung von nur einem Well pro Bild ermöglichen. Schieben Sie die Bühne nach oben (Sichtfeld oder FOV von 5 cm) und platzieren Sie die Vertiefung, die abgebildet werden soll, direkt unter der Kamera.
5. Stellen Sie die Bildgebungszeit in Abhängigkeit von der Intensität der Luziferase, die der Tumor abgibt, auf die am besten geeignete Zeit ein, die zwischen 10 s und 5 min variieren kann. Beginnen Sie mit der Einstellung auf 10 s und erhöhen Sie sie dann, wenn das Signal niedrig ist, aber halten Sie sie für alle Zeitpunkte und Bedingungen bis zum Ende des Experiments konstant (Abbildung 1D).
6. Verwenden Sie das ROI-Tool (Kreisform-Tool), passen Sie es an die Tumorform und -größe an, messen Sie den ROI und melden Sie die Gesamtmesswerte, um das Biolumineszenzsignal jedes Tumors auf der Scheibe zu quantifizieren.

Ergebnisse

Abbildung 1. Intrakranielle Injektion, Generierung von Hirnschnitten und BCBM-Wachstum ex vivo. (A) Schematische Darstellung einer Maus während der intrakraniellen Injektion unter einem stereotaktischen Instrument. (B) Repräsentative Bilder...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ml Spritze, Slip Tip	BD	309659
30 G1/2 Nadeln	BD	305106
6-Well-Platten	Genessee	25-105
Automatisiertes Mikroskop und LUMAVIEW Software	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
Becher 50	mL Fisher	10-210-685
Stumpfer Zobelpinsel, Größe #5/0	Elektronenmikroskopie	66100-50
Knochenwachs	ModoMed	DYNJBW25
Gehirninjektionsspritze	Hamilton Company	80430
CaCl₂	Fisher Scientific	BP510-250
D-Luciferin Kaliumsalz	Perkin Elmer	122799
Doppelschneidige Rasierklinge	VWR	55411-060(95-0043)
Filterpapier , quantitative Kreise, 4,25 cm	Fisher	09-805a (1001-042)
Feiner Zobelpinsel #2/0	Elektronenmikroskopie Sciences	66100-20
Pinzette	Fine Science Tools	11251-20
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Glutamin (200 mM)	Corning cellgrow	25-005-Cl
Handbohrer-Set mit Micro Mini Spiralbohrern	Amazon	YCQ2851920086082DJ
HEPES, freie	Säure Fisher Scientific	BP299-1
Nur für Mäuse Stereotaxic Frame	Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
Große chirurgische Schere	Fine Science Tools	14001-18
MDA-MB-231BR Zellen	Mit freundlicher Verfügung von Dr. Patricia Steeg	Ref 14
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	M33-500
Mäuse-Bildgebungsgerät	Perkin Elmer	IVIS 200 System
Mäuse-Bildgebungssoftware	Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).	Living Image Software
Microplate Reader	Tecan Spark
Eindecklösung	Invitrogen	P36935
MTS Reagenz	Promega CellTiter 96 Wässrig Eine Lösung	(Kat:G3582)
N2 Ergänzung	Life Technologies	17502-048
Neurobasales Medium	Leben Technologien	21103049
athymischen Nu/Nu-Mäusen	Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
Paraformaldehyd	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
Polypropylen-Naht	Medex Versorgung	ETH-8556H
Povidon-Jod-Tupfer Sticks	DME Supply USA	Cat: 689286X
Skalpellklinge #11 (Packung mit 100)	Fine Science Tools	10011-00
Skalpellgriff #	Fine Science Tools	10003-12
Natriumpyruvat	Sigma Aldrich	S8636
Spatel/Sonde	Fine Science Tools	10090-13
SS Doppelschneidige unbeschichtete Rasierklingen (American Safety Razor Co (95-0043))	VWR	55411-060
Saccharose	Amresco	57-50-1
Chirurgisches Skalpell	Exelint International	D29702
Gewebehacker	Brinkman	(McIlwain-Typ)
Gewebekultureinsätze	Millipore	PICMORG50 oder PICM03050

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