Bildgebung der zweiten harmonischen Generation in einem Rattenmodell zur Untersuchung von Tubulindefekten

Zusammenfassung

Quelle: Piazza, V., et al., Markierungsfreie nichtlineare Optik zur Untersuchung von Tubulin-abhängigen Defekten im zentralen Myelin. J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Bildgebung von Mikrotubuli-Anomalien in einem Hirngewebeschnitt einer Ratte mit einem Zwei-Photonen-Anregungsmikroskop. Es verwendet Signale der zweiten harmonischen Generation (SHG), um Tubulindefekte und eine verminderte Myelinproduktion zu erkennen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Übertragen Sie es in das Mikroskop

1. Wenn sich das Mikroskop in einem anderen Raum befindet, bereiten Sie eine isolierte Box mit erwärmten Gelpacks vor, um die Gewebeschnitte unter Beibehaltung der Temperatur zu übertragen. Die Box hält die Abschnitte auch warm, bis sie abgebildet werden.
2. Legen Sie die Probe unter das Mikroskop und stellen Sie sicher, dass sie durch direkte Beobachtung durch das Okular mit Durchlicht richtig unter dem Objektiv positioniert ist.
   HINWEIS: Das Ziel ist es, die vorhergesagten emittierenden Strukturen mit der Schwingungsrichtung des Lasers auszurichten, um das emittierte (und daher detektierte) Signal zur Erzeugung zweiter harmonischer Strahlung (SHG) zu maximieren.
3. Entfernen Sie das überschüssige HBSS, so dass ein dünner Flüssigkeitsfilm die gesamte Probe bedeckt. Überprüfen Sie den Flüssigkeitsfilm alle paar Minuten visuell, um eine übermäßige Verdunstung und Austrocknung der Probe zu vermeiden.
   HINWEIS: Unter den beschriebenen Bedingungen wird ein Abschnitt nicht länger als 20 Minuten verwendet. Das Trocknen der Probe führt zu drastischen künstlichen Effekten (Abbildung 1A). Wenn längere Bildgebungszeiten erforderlich sind, wird empfohlen, den Schnitt regelmäßig in einem warmen, frischen Medium einzuweichen, anstatt mehr HBSS hinzuzufügen. Die Verwendung von Perfusionskammern und Kleber oder niedrigschmelzender Agarose zur Immobilisierung des Gewebes wird auch empfohlen, wenn längere Experimente durchgeführt werden sollen.
4. Bereiten Sie den Mikroskoptisch für die nicht degescannte Bildgebung vor, z. B. indem Sie alle Türen der dunklen Inkubationskammer schließen oder die Inkubationskammer mit einem schwarzen, mit Nylon und Polyurethan beschichteten Gewebe abdecken.

2. Bildgebung

1. Wählen Sie den Bildgebungsmodus "nicht descannt" entlang des Übertragungswegs. Auf diese Weise wird die Erfassung des schwachen SH-Signals von Tubulin optimiert.
2. Wählen Sie das Objektiv LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA aus.
3. Stellen Sie eine Laserleistung zwischen 13 mW und 26 mW ein, mit einer Pixelverweilzeit von 12,6 μs. Nehmen Sie Bilder auf, die nicht größer als 512 x 512 Pixel sind, mit einer Geschwindigkeit von 5 und einem Mittelwert von 2 für eine durchschnittliche Erfassungszeit von etwa 15 s.
   HINWEIS: Die Verwendung höherer Laserleistungen und/oder längerer Verweilzeiten kann die Probe beschädigen (Abbildung 1B).
4. Nehmen Sie zunächst Bilder mit einem 485-nm-Kurzpassfilter (SP485) auf und fügen Sie in einem zweiten Schritt einen scharfen 405-nm-Bandpassfilter (BP405; Abbildung 2).
   HINWEIS: Pseudo-Hellfeld-Bilder können durch denselben Detektor aufgenommen werden, wobei das verbleibende Laserlicht einer sichtbaren Linie verwendet wird (405 nm oder 488 nm Laser funktionieren am besten).

Ergebnisse

Abbildung 1: Beispiele für Artefakte. (A) Artefakt durch Trocknung der Probe. (B) Artefakt durch übermäßige Exposition. Maßstabsleisten: 30 μm.

Materialien