Konfokale Zeitraffer-Bildgebung der neuronalen dendritischen Dynamik in retinalen Explantaten der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. Zeitraffer-Bildgebung der neuronalen Arborisierung unter Verwendung der spärlichen Adeno-assoziierten Virusmarkierung von genetisch ausgerichteten retinalen Zellpopulationen. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert den Einsatz der konfokalen Mikroskopie zur Visualisierung der dendritischen Dynamik in lebenden Netzhautexplantaten von Mäusen. Es beschreibt die Schritte zur Stabilisierung der Netzhaut unter einem konfokalen Mikroskop, zur Durchführung von Epifluoreszenzbildgebung zur Visualisierung von Starburst-Amakrin-Interneuronen und zur Aufnahme von Zeitraffer-3D-Bildern zur Überwachung von Veränderungen in der amakrinen dendritischen Morphologie.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tierproben verwendet werden, wurden von der zuständigen Kommission für die ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von lebenden Netzhautpräparaten mit ganzer Halterung

1. Bauen Sie die Inkubationskammer für die Live-Bildgebung für ein aufrechtes konfokales Mikroskop zusammen, wie in Abbildung 1 zu sehen ist.
   HINWEIS: Bei invertierten konfokalen Systemen werden Flat-Mounts mit der Seite nach unten mit den retinalen Ganglienzellen (RGC) direkt auf das untere Glasdeckglas der Inkubationskammer gelegt. Sobald die Netzhaut mit dem Deckglas in Kontakt kommt, kann sie nicht mehr bewegt werden.
2. Füllen Sie die Kammer mit sauerstoffhaltiger künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) und schalten Sie die Pumpe und den Temperaturregler ein (Temperatur 32-34 °C, Durchflussrate 1 ml/min). Lassen Sie die Temperatur nicht über 34 °C ansteigen.
3. Um das retinale Flat-Mount in die Perfusionskammer zu übertragen, stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie das aCSF, das sich in der Kammer befindet. Legen Sie die MCE-Scheibe (Mixed Celluloseester) mit dem retinalen Flat-Mount in die (leere) Inkubationskammer.
4. Platzieren Sie ein Probengewicht auf der flachen Halterung. Befeuchten Sie das Gewicht vor, um die Oberflächenspannung zu brechen. Füllen Sie die Kammer wieder mit dem erwärmten aCSF und zirkulieren Sie aCSF bei ~1 mL/min.
5. Positionieren Sie den Objektivrevolver mit dem 25-fachen Wassertauchobjektiv (numerische Apertur 0,95) in der Bildgebungskammer. Screening nach den markierten Zellen von Interesse mit Epifluoreszenzlicht (Abbildung 1C).
6. Passen Sie das Bildvolumen an, um dendritische Merkmale von Interesse zu erfassen.
   HINWEIS: Diese Studie erfasste den gesamten dendritischen Dorn bei 1024 x 1024 Pixeln pro Frame, einem Z-Schritt von 1 μm und einer Bildrate von 2 min zwischen jedem Z-Stack. Die endgültigen Bildgrößen betragen ~100 μm x 100 μm x 20 μm.
7. Um die Laserleistung auf eine optimale Einstellung einzustellen, verwenden Sie eine Nachschlagetabelle, die sowohl übersättigte als auch untersättigte Pixel identifiziert. Passen Sie die Laserleistung während des Scannens so an, dass keine Pixel übersättigt sind (d. h. bei einer Intensität von 255 oder mehr). Setzen Sie die Bildgebung so lange wie nötig fort oder bis es zu einem signifikanten und nachweisbaren Rückgang des Fluoreszenzsignals und einer Zunahme des Rauschens kommt (typischerweise 2-4 Stunden).
   HINWEIS: Eine reduzierte Laserleistung wird empfohlen, da Dekonvolutionsalgorithmen optimal funktionieren, wenn die Pixel über den vollen Dynamikbereich verteilt sind. Die Pixelintensität sollte 254 nicht überschreiten. Empirische Analysen von Neuriten zeigten, dass Pixelwerte unter 170 ideal für die Entfaltung sind. Schnelle Scangeschwindigkeiten (400-600 Hz) mit Zeilenmittelung (2-3) sind einzelnen, langsameren Scans mit der gleichen Gesamtpixelverweilzeit vorzuziehen. Der Bereich der verlängerten Bildgebung bleicht häufig aus, aber andere Explantatabschnitte bleiben lebensfähig. Es können mehrere Regionen in einem Flatmount abgebildet werden, jeweils für 2-4 Stunden, mit einer Gesamtinkubationszeit von 6 Stunden. Bildgebende Verfahren nach 6 Stunden wurden nicht systematisch getestet. Der Abbau von Neuriten und das Blabbing sind Anzeichen dafür, dass die Lebensfähigkeit des Explantats abnimmt.

Ergebnisse

Abbildung 1: Aufbau der Inkubationskammer für die Bildgebung lebender Zellen. (A) Inkubationsvorrichtung mit Live-Bildgebung, die die Komponenten für Erwärmung, Lösung und Bildgebung zeigt. Die Dual-Heizung umfasst eine beheizte Inkubationska...

Materialien