Bildgebung und Quantifizierung der axonalen Regeneration in axotomisierten retinalen Ganglienneuronen von Ratten

Zusammenfassung

Quelle: Portela-Lomba, M., et. al. Kokultur von axotomisierten retinalen Ganglienneuronen der Ratte mit olfaktorischer Enclosing-Glia, als In-vitro-Modell der axonalen Regeneration bei Erwachsenen. J. Vis. exp. (2020).

Dieses Video zeigt die Bildgebung und Quantifizierung der axonalen Regeneration in axotomisierten retinalen Ganglienneuronen (RGNs) der Ratte, die mit immortalisierten menschlichen olfaktorischen Gliazellen kokultiviert wurden. RGNs sind immunmarkiert, mit roten Somas und grünen Axonen. Die Bilder wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen, und der Prozentsatz der Neuronen mit einem Axon- und axonalen Regenerationsindex wurde mit Hilfe einer Bildgebungssoftware quantifiziert.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Kultur der menschlichen olfaktorischen Enclosing-Glia (ihOEG, Ts12 und Ts14)

HINWEIS: Dieses Verfahren wird unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank für Gewebekulturen durchgeführt.

1. Bereiten Sie 50 mL ME10 OEG-Nährmedium vor.
2. Bereiten Sie 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium oder DMEM/F12-Fetal Rinderserum (FBS) in einem konischen 15-ml-Röhrchen vor.
3. Beide Medien 15 Min. lang bei 37 °C in einem sauberen Wasserbad erwärmen.
4. Ts12- und Ts14-Zellfläschchen bei 37 °C in einem sauberen Wasserbad auftauen.
5. Resuspendieren Sie das in Schritt 2 vorbereitete DMEM/F12-FBS-Kulturmedium und fügen Sie es hinzu.
6. 5 min bei 200 x g zentrifugieren.
7. Den Überstand anstreben.
8. Geben Sie 500 μl ME10-Medium hinzu und resuspendieren Sie das Pellet.
9. Bereiten Sie eine p60-Zellkulturschale mit 3 ml ME10 vor und fügen Sie die Zellsuspension tropfenweise hinzu.
10. Bewegen Sie die Bewegung, um die Zellen gleichmäßig über die Platte zu verteilen.
11. Kultivieren Sie Zellen bei 37 °C in 5 % CO₂.
    HINWEIS: Nach Erreichen der Konfluenz muss mindestens eine weitere Passage durchgeführt werden, um die Zellen für die Kokultur zu optimieren. 90 % Konfluenz ist erforderlich, bevor sie für die Kokultur auf die Deckgläser gesät werden. Ein konfluentes p-60 hat eine mittlere Zellzahl von 7 x 10⁵ für Ts14 und 2,5 x 10⁶ für Ts12-Zelllinien. Die Zelllinien Ts12 und Ts14 sollten alle 2–3 Tage durchgelassen werden.

2. Vorbereitung des ihOEG (Ts12 und Ts14) für den Assay

HINWEIS: Dieser Schritt muss 24 Stunden vor der Dissektion und Kokultur der retinalen Ganglienneuronen (RGNs) durchgeführt werden.

1. Deckgläser mit einem Ø von 12 mm 1 h mit 10 μg/mL Poly-L-Lysin (PLL) behandeln.
   HINWEIS: Die Deckgläser können über Nacht in der PLL-Lösung belassen werden.
2. Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS).
3. Ts12 und Ts14 ihOEG-Zellen aus der p60-Zellkulturschale lösen.
   1. Geben Sie 4 ml DMEM/F12-FBS-Kulturmedium in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Bei 37 °C in einem sauberen Wasserbad erwärmen.
   2. Nehmen Sie das Medium von den Platten und waschen Sie die Zellen einmal mit 1x 1x PBS-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
   3. Geben Sie 1 ml Trypsin-EDTA in die OEG-Zellen und inkubieren Sie sie 3–5 Minuten lang bei 37 °C, 5 % CO₂.
   4. Entnehmen Sie die Zellen mit einer p1000-Pipette und überführen Sie sie in das in Schritt 3.1 vorbereitete Medium.
   5. 5 min bei 200 x g zentrifugieren.
   6. Den Überstand anstreben.
   7. Fügen Sie 1 ml ME10-Medium hinzu und resuspendieren Sie das Pellet.
   8. Zählen Sie die Zellzahl in einem Hämozytometer.
4. 80.000 Ts14-Zellen oder 100.000 Ts12-Zellen/Well in 24-Well-Platten mit 500 μl ME10-Medium auf die Deckgläser säen.
5. Kultivieren Sie Zellen bei 37 °C in 5 % CO₂ für 24 h.

3. Dissektion von Netzhautgewebe

HINWEIS: Als RGN-Quelle werden 2 Monate alte männliche Wistar-Ratten verwendet. Zwei Netzhäute (eine Ratte) für 20 Vertiefungen einer 24-Well-Zellschale. Autoklavieren Sie chirurgisches Material vor dem Gebrauch. Das Papain-Dissoziationskit ist im Handel erhältlich (Table of Materials). Befolgen Sie die Anweisungen des Anbieters für die Rekonstitution. D, L-2-amino-5-phosphonovaleriansäure (APV) in 5 mM Stamm rekonstituieren und die Aliquote vorbereiten.

1. Bereiten Sie am Tag des Assays die folgenden Medien vor.
   1. Bereiten Sie eine p60-Zellkulturschale mit 5 ml kalter Earle's Balanced Salt Solution oder EBSS vor (Fläschchen 1 des Papain-Dissoziationssets).
   2. Bereiten Sie eine p60-Zellkulturschale mit rekonstituiertem Fläschchen 2 (Papain) des Papain-Dissoziationskits plus 50 μl APV vor. Fügen Sie dann 250 μl rekonstituiertes Fläschchen 3 (DNase plus 5 μl APV) hinzu.
   3. Mischen Sie in einem sterilen Röhrchen 2,7 ml Durchstechflasche 1 mit 300 μl Durchstechflasche 4 (Albumin-Ovomucoid-Protease-Inhibitor). Fügen Sie 150 μl Fläschchen 3 (DNase) plus 30 μl APV hinzu.
   4. Bereiten Sie 20 ml Neurobasal-B27-Medium (NB-B27) vor.
2. Opfere eine Ratte durch Ersticken mit CO₂.
3. Entfernen Sie den Kopf durch Enthauptung mit einer Guillotine; Legen Sie es in eine 100 mm Petrischale und besprühen Sie den Kopf mit 70 % Ethanol, bevor Sie es in eine Laminar-Flow-Haube legen.
4. Schneide die Schnurrhaare der Ratte mit einer Schere ab, damit sie die Augenmanipulation nicht beeinträchtigen.
5. Fassen Sie den Sehnerv mit einer Zange, um den Augapfel so weit herauszuziehen, dass Sie mit einem Skalpell einen Schnitt quer durch das Auge machen können.
6. Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper und ziehen Sie die Netzhaut (orangefarbenes Gewebe) heraus, während die restlichen Schichten des Auges im Inneren verbleiben (einschließlich der Pigmentepithelschicht).
7. Legen Sie die Netzhaut in die in Schritt 3.1.1 vorbereitete p60-Zellkulturschale.
8. Übertragen Sie die Netzhaut in die in Schritt 3.1.2 vorbereitete p60-Zellkulturschale und schneiden Sie sie mit dem Skalpell in kleine Stücke von ungefähr der Größe < 1 mm.
9. In ein 15-ml-Kunststoffröhrchen geben.
10. Inkubieren Sie das Gewebe 30 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5 % CO₂ und rühren Sie alle 10 Minuten.
11. Dissoziieren Sie Zellklumpen, indem Sie mit einer Pasteur-Glaspipette auf und ab pipettieren.
12. Die Zellsuspension wird 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert.
13. Den Überstand verwerfen und zur Inaktivierung von Papain das Zellpellet in der in Schritt 3.1.3 hergestellten Lösung resuspendieren. (1,5 mL für 2 Augen).
14. Pipettieren Sie diese Zellsuspension vorsichtig in 5 ml des rekonstituierten Fläschchens 4.
15. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 200 x g.
16. Entfernen Sie während des Zentrifugierens das ME-10-Medium vollständig von der OEG 24-Well-Zellplatte (zuvor in Schritt 2 vorbereitet) und ersetzen Sie es durch 500 μl NB-B27-Medium pro Well.
17. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml NB-B27-Medium.
18. Platte 100 μl retinale Zellsuspension, pro Vertiefung der m24-Platte, auf PLL-behandelte oder OEG-Monolayer-Deckgläser.
19. Die Kulturen werden 96 h lang bei 37 ΰC mit 5 % CO₂ im Medium NB-B27 aufbewahrt.

4. Immunfärbung

1. Nach 96 h fixieren Sie die Zellen für 10 Minuten, indem Sie dem Kulturmedium (600 μl) das gleiche Volumen von 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS zusetzen (PFA-Endkonzentration 2 %).
2. Entfernen Sie das Medium und das PFA von der 24-Multiwell-Platte und fügen Sie erneut 500 μL 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS hinzu. 10 Min. inkubieren.
3. Fixierer verwerfen und 5 Min. 3 Mal mit 1x PBS waschen.
4. Block mit 0,1% Triton X-100/1% FBS in PBS (PBS-TS) für 30–40 min.
5. Die primären Antikörper im PBS-TS-Puffer wie folgt vorbereiten: Monoklonaler Antikörper SMI31 (gegen MAP1B- und NF-H-Proteine) (1:500). 514 (erkennt MAP2A- und B-Proteine) polyklonales Kaninchen-Antiserum (1:400).
6. Geben Sie Primärantikörper in Kokulturen und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
7. Am nächsten Tag entsorgen Sie die Antikörper und waschen Sie die Deckgläser mit 1x PBS, 3 mal, für 5 min.
8. Bereiten Sie die Sekundärantikörper in PBS-TS-Puffer wie folgt vor: Für SMI-31 Anti-Maus Alexa Fluor 488 (1:500). Für 514, Anti-Kaninchen-Alexa-594 (1:500).
9. Inkubieren Sie die Zellen mit den entsprechenden fluoreszierenden Sekundärantikörpern für 1 h, bei Raumtemperatur oder RT im Dunkeln.
10. Waschen Sie die Deckgläser mit 1x PBS, 3 Mal, 5 min, im Dunkeln.
11. Zum Schluss werden Deckgläser mit Eindeckmedium (Table of Materials) montiert und bei 4 °C gehalten.
    HINWEIS: Bei Bedarf kann eine Fluoreszenzkernfärbung mit DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol) durchgeführt werden. Vor der Montage die Zellen 10 min im Dunkeln mit DAPI inkubieren (10 μg/mL in 1x PBS). Waschen Sie die Deckgläser 3 Mal mit 1x PBS und montieren Sie zum Schluss die Deckgläser mit dem Eindeckmedium.

5. Quantifizierung der axonalen Regeneration

HINWEIS: Die Proben werden unter dem 40-fachen Objektiv eines Epifluoreszenzmikroskops quantifiziert. Für jede Behandlung sollten mindestens 30 Bilder auf Zufallsfeldern mit mindestens 200 Neuronen aufgenommen werden, die quantifiziert werden können. Jedes Experiment sollte mindestens dreimal wiederholt werden.

1. Quantifizieren Sie den Prozentsatz der Neuronen mit Axon (SMI31 positiver Neurit) im Verhältnis zur Gesamtpopulation von RGNs (identifiziert mit MAP2A/B 514 positiver Immunfärbung des neuronalen Körpers und der Dendriten).
2. Quantifizieren Sie den axonalen Regenerationsindex oder die mittlere axonale Länge (μm/Neuron). Dieser Parameter ist definiert als die Summe der Längen (in μm) aller identifizierten Axone, dividiert durch die Gesamtzahl der gezählten Neuronen, unabhängig davon, ob sie ein Axon darstellten oder nicht. Die Bestimmung der Axonlänge erfolgt mit dem Plugin NeuronJ der Bildsoftware ImageJ (NIH-USA).
3. Berechnen Sie den Mittelwert, die Standardabweichung und die statistische Signifikanz mit der entsprechenden Software.

Materialien