Zellbildgebung mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

Abstract

Quelle: Daniele, F., et. al TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden zur Bewertung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Zellbildgebung und Datenanalyse. J. Vis. exp. (2015).

Dieses Video zeigt die Bildgebung von humanen Neuroblastomzellen mit einem Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop (TIRF), um mit Fluorophoren markierte synaptische Vesikel sichtbar zu machen. Die Zellen werden zunächst im Epifluoreszenzmodus fokussiert. Anschließend werden Anpassungen vorgenommen, um eine interne Totalreflexion zu erreichen, wodurch evaneszente Wellen erzeugt werden, die selektiv Fluorophore in der Nähe der Membran anregen. Vor der TIRF-Bildgebung werden die Erfassungsparameter konfiguriert und die Abtastfrequenz eingestellt.

Protocol

1. Zellkultur und Transfektion

1. SH-SY5Y Zellkultur
   HINWEIS: Die Experimente wurden mit dem humanen Neuroblastom SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266) durchgeführt. SH-SY5Y-Zellen wachsen als eine Mischung aus schwimmenden Clustern und adhärenten Zellen. Befolgen Sie die im Protokoll angegebenen Anweisungen (Zelldichte, Spaltungsverhältnis usw.), um Zellen zu haben, die fest mit der Glasabdeckung verbunden sind, was für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) von entscheidender Bedeutung ist.
   1. Bevor Sie beginnen, stellen Sie unter der Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank das geeignete Volumen der sterilen ....

Results

Abbildung 1. Einrichtung des TIRF-Mikroskops. Schematische Ansicht und Bild (Einschub) des TIRF-Mikroskopsystems. Der Aufbau besteht aus dem motorisierten inversen Mikroskop Axio Observer Z1 (A), einem mehrzeiligen 100-mW-Argon-Ionenlaser (.......

Materials