Zellbildgebung mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

Abstract

Quelle: Daniele, F., et. al TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden zur Bewertung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Zellbildgebung und Datenanalyse. J. Vis. exp. (2015).

Dieses Video zeigt die Bildgebung von humanen Neuroblastomzellen mit einem Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop (TIRF), um mit Fluorophoren markierte synaptische Vesikel sichtbar zu machen. Die Zellen werden zunächst im Epifluoreszenzmodus fokussiert. Anschließend werden Anpassungen vorgenommen, um eine interne Totalreflexion zu erreichen, wodurch evaneszente Wellen erzeugt werden, die selektiv Fluorophore in der Nähe der Membran anregen. Vor der TIRF-Bildgebung werden die Erfassungsparameter konfiguriert und die Abtastfrequenz eingestellt.

Protocol

1. Zellkultur und Transfektion

1. SH-SY5Y Zellkultur
   HINWEIS: Die Experimente wurden mit dem humanen Neuroblastom SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266) durchgeführt. SH-SY5Y-Zellen wachsen als eine Mischung aus schwimmenden Clustern und adhärenten Zellen. Befolgen Sie die im Protokoll angegebenen Anweisungen (Zelldichte, Spaltungsverhältnis usw.), um Zellen zu haben, die fest mit der Glasabdeckung verbunden sind, was für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) von entscheidender Bedeutung ist.
   1. Bevor Sie beginnen, stellen Sie unter der Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank das geeignete Volumen der sterilen Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) und des Kulturmediums her.
      1. Stellen Sie 50 ml PBS mit Konzentrationen von 150 mM Natriumchlorid (NaCl), 24 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 her. Filtern Sie die Lösung.
      2. Stellen Sie 50 ml Zellmedium aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml), L-Glutamin (2 mM) und Natriumpyruvat (1 mM) her. Filtern Sie die Lösung.
   2. Entfernen Sie das komplette Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit 3 ml PBS.
   3. Inkubieren Sie die Zellen mit 2 ml 0,05 % Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (für eine 6 cm Petrischale) für 5 min bei 37 °C, 5 % CO_2, und lösen Sie die Zellen mit einer Pipette ab.
   4. Inaktivieren Sie Trypsin durch Zugabe von 2 ml DMEM und sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min.
   5. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie dem Pellet 1 ml DMEM hinzu und pipettieren Sie die Lösung ausreichend auf und ab, um die Zellen in eine Einzelzellsuspension zu dispergieren.
   6. Teilen Sie sie 1:4 in eine neue Petrischale mit einem Durchmesser von 6 cm auf, die 3 ml vollständiges Medium enthält. Halten Sie die Zellen in Kultur in Petrischalen mit einem Durchmesser von 6 cm bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO₂. Subkultur einmal pro Woche, oder wenn sie 80 - 90% der Fläche bedeckt haben.
2. SH-SY5Y-Zellplattierung für die Bildgebung
   1. Für TIRFM-Experimente werden Plattenzellen auf Glasabdeckungen platziert. Verwenden Sie Glasabdeckungen mit einer Dicke von 0,17 ± 0,005 mm und einem Brechungsindex von 1,5255 ± 0,00015. Bevor Sie beginnen, bereiten Sie die Glasdeckgläser wie folgt vor:
      1. Reinigen Sie die Glasabdeckungen über Nacht (O/N) mit 90% Ethanol.
      2. Spülen Sie sie gründlich in destilliertem Wasser ab (dreimaliger Wechsel des destillierten Wassers). Trocknen Sie Glasabdeckungen in einem Trockenofen.
      3. Legen Sie die Abdeckungen in die Petrischalen aus Glas und sterilisieren Sie sie im vorgeheizten Backofen bei 200 °C für 3 Std.
   2. Am Tag vor der Transfektion legen Sie jedes Deckglas in eine 3,5 cm große Petrischale, fügen Sie 1 ml Nährmedium hinzu und inkubieren Sie es bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO₂.
   3. Trypsinisieren Sie die Zellen wie in den Schritten 1.1.3 bis 1.1.5 beschrieben, suspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml vollständigem Medium und zählen Sie. Berechnen Sie das richtige Volumen der Zellsuspension, das jeder Petrischale hinzugefügt wird, um 3 x 10⁵ Zellen/Vertiefung zu erhalten. Diese Dichte ist für ein optimales Zellwachstum und eine effiziente Transfektion erforderlich. Inkubieren bei 37 °C in einem 5%igen CO₂ Inkubator O/N.
3. SH-SY5YTransfektion durch Polyethylenimin (PEI)
   HINWEIS: Um die Dynamik der synaptischen Vesikel sichtbar zu machen, wurde ein pCB6-Vektor verwendet, der Synapto-pHluorin enthält. Das Synapto-pHluorin wurde durch In-Frame-Fusion einer pH-sensitiven Variante des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und des vesikulären Membranproteins Synaptobrevin 2 erzeugt. Das Konstrukt wurde ausgiebig eingesetzt, um synaptische Vesikeleigenschaften in Neuronen zu untersuchen.
   1. Bevor Sie mit der Transfektion beginnen, stellen Sie 10 ml der folgenden Lösungen her. Bewahren Sie die Lösungen maximal 1 Monat lang auf.
      1. Stellen Sie eine 150 mM NaCl-Lösung her. Auf pH 5,5 mit 0,01 N Salzsäure (HCl) einstellen.
      2. Eine PEI-Lösung aus 10 % Polyethylenimin (PEI; 25 kDa linear) in 150 mM NaCl-Lösung herstellen. Der pH-Wert der Lösung steigt auf 8,8. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,8 mit 0,01 N HCl ein.
   2. 24 Stunden nach dem Plattieren entfernen Sie das Medium und erfrischen Sie es mit 1,5 ml vollständigem Medium. Halten Sie die Zellen bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO₂.
   3. Unter der Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank werden in einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen 3 μg Plasmid-DNA zu 25 μl 150 mM NaCl-Lösung und 100 μl PEI-Lösung pro 3,5 cm Petrischale gegeben.
   4. 10 Sekunden lang vortexen, dann das DNA/PEI-Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
   5. Geben Sie das DNA/PEI-Gemisch vorsichtig in die Petrischale, die Deckgläser mit Zellen enthält, und schütteln Sie es vorsichtig, um das Reagenz gleichmäßig in der Petrischale zu verteilen.
   6. Nach 4 Stunden wird das Medium gewechselt und die Zellen O/N bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO₂ inkubiert. Führen Sie bildgebende Experimente 24 - 48 Stunden nach der Transfektion durch.

2. Zellbildgebung mit TIRFM

1. Bildgebungsaufbau
   1. Führen Sie die TIRF-Bildgebung mit dem in Abbildung 1 beschriebenen Aufbau durch. Es besteht aus einem motorisierten inversen Mikroskop (Abbildung 1, Einschub A), der Laserquelle (Abbildung 1, Einschub B) und dem TIRF-Schieber (Abbildung 1, Einschub C). Erreichen Sie TIRFM-Beleuchtung durch ein 100-faches Öl-Immersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA 1,45 Alpha Plan-Fluar).
   2. Für die TIRFM-Beleuchtung verwenden Sie einen Mehrlinienlaser (458/488/514 nm) mit 100 mW Argon-Ionen. Mit einer Monomode-Faser wird das linear polarisierte Laserlicht über den TIRF-Schieberegler in den Strahlengang eingebracht. Setzen Sie den TIRF-Schieberegler in die Leuchtfeldblende des Auflichtstrahlengangs ein.
      1. Für eine Weitfeldausleuchtung schließen Sie das Mikroskop an eine herkömmliche Quecksilber-Kurzbogenlampe HBO White Light an. Ein polarisationserhaltendes Doppelprisma im Schieber sorgt für die gleichzeitige Kombination von TIRF-Beleuchtung und weißem Licht.
   3. Filtern Sie das Laserlicht mit einem Anregungsfilter (Bandbreite 488/10 nm), der auf einem Filterrad montiert und in den Lasergang eingebracht wird. Verwenden Sie einen softwaregesteuerten Hochgeschwindigkeits-Shutter, um eine schnelle Steuerung der Laserbeleuchtung zu ermöglichen. Für die pHluorin-Analyse montieren Sie einen Bandpass-Emissionsfilter von 525/50 nm. Nehmen Sie digitale Bilder (512 x 512 Pixel) mit einer gekühlten Fast CCD-Kamera mit der Image ProPlus-Software auf.
2. Erreichen einer TIRF-Beleuchtung (Abbildung 2)
   1. Schalten Sie die Laser, den Computer, die Kamera, das Filterrad und die Verschlussregler ein; Warten Sie dann 20 Minuten, bevor Sie mit dem Experiment beginnen, da sich die Laser erwärmen und stabilisieren müssen.
   2. Machen Sie vor dem Imaging das passende Volumen der folgenden Lösungen.
      1. Herstellung von 50 ml Krebs (KRH)-Lösung mit 125 mM NaCl, 5 mM Kaliumchlorid (KCl), 1,2 mM Magnesiumsulfat (MgSO₄), 1,2 mM Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄), 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) (gepuffert auf pH 7,4), 2 mM Calciumchlorid (CaCl₂), und 6 mM Glukose.
      2. 10 ml KCl-KRH-Lösung (pH 7,4) mit 80 mM NaCl, 50 mM KCl, 1,2 mM MgSO₄, 1,2 mM KH₂PO₄, 25 mM HEPES (gepuffert auf pH 7,4), 2 mM CaCl₂ und 6 mM Glukose herstellen.
   3. Entfernen Sie die Glasabdeckung mit den transfizierten Zellen und setzen Sie sie in die entsprechende Bildgebungskammer ein. Bauen Sie die Kammer zusammen und geben Sie 500 μl KRH-Lösung in die Mitte des Glases.
   4. Öl über das Objektiv geben. Stellen Sie die Bildgebungskammer auf den Tisch des Mikroskops und positionieren Sie das Objektiv unter dem Glasdeckglas. Positionieren Sie die sichere Abdeckung über der Probe.
   5. Im Epifluoreszenzmodus fokussieren Sie sich auf das Deckglas (obere Oberfläche) und wählen Sie die transfizierten Zellen aus, die in der Mitte der Kammer platziert sind. Wählen Sie Zellen aus, deren Fluoreszenzsignal mit einer Belichtungszeit unter 80 ms eindeutig aufgezeichnet werden kann.
   6. Schalten Sie unter Softwaresteuerung auf TIRF-Beleuchtung im Live-Modus um.
   7. Um die TIRF-Konfiguration einzustellen, überprüfen Sie die Position des Strahls, der aus dem Objektiv auf der Probenabdeckung austritt (Abbildung 2B). Wenn der Strahl in der Mitte der Objektivlinse positioniert ist (Abbildung 2A, links), ist ein Fleck in der Mitte der TIRF-Probenabdeckung sichtbar (Abbildung 2B, links), und die Zelle wird im Epifluoreszenzmodus abgebildet (mehrere Fokusebenen, hohe Hintergrundfluoreszenz; Abbildung 2C, links).
   8. Um den kritischen Winkel zu erreichen, bewegen Sie den fokussierten Punkt in Y-Richtung (vorwärts oder rückwärts; Abbildung 2B, Mitte) mit der Winkeleinstellschraube am TIRF-Schieberegler (Abbildung 1C). Wenn der Strahl in einem Winkel größer als der kritische Winkel auf die Probenebene trifft (Abbildung 2A, rechts), verschwindet der Fleck und in der Mitte der Probenabdeckung ist eine gerade, dünne, fokussierte Linie zu sehen (Abbildung 2B, rechts).
   9. Um den TIRF-Winkel fein abzustimmen, verwenden Sie die Zellprobe (Abbildung 2C). Sehen Sie sich das Fluoreszenzbild im Video an. Zu diesem Zeitpunkt ist noch ein epifluoreszenzähnliches Bild zu sehen. Bewegen Sie die Schraube vorsichtig, bis der TIRF-Zustand erreicht ist: Nur eine optische Ebene der Zelle ist scharf (d. h. die Plasmamembran in Kontakt mit dem Deckglas). Das Ergebnis ist ein flaches Bild mit hohem Kontrast (Abbildung 2C, rechts).
3. Beispiel-Imaging
   1. Festlegen des Einkanal-Zeitraffer-Experiments. Um Photobleaching zu minimieren, nehmen Sie das Bild mit einer kurzen Belichtungszeit und einer hohen Verstärkung auf. Geeignete Belichtungszeiten liegen zwischen 40 - 80 ms. Erfassen Sie Bilder mit einer Abtastfrequenz von 1 bis 2 Hz. Die Vesikelkinetik kann bei einer höheren Frequenz (10 Hz) besser geschätzt werden. Die reguläre Beobachtungszeit beträgt in der Regel 2 Minuten.

Results

Abbildung 1. Einrichtung des TIRF-Mikroskops. Schematische Ansicht und Bild (Einschub) des TIRF-Mikroskopsystems. Der Aufbau besteht aus dem motorisierten inversen Mikroskop Axio Observer Z1 (A), einem mehrzeiligen 100-mW-Argon-Ionenlaser (...

Materials