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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Mikroinjektion
- Bereiten Sie eine sterile Operation vor, indem Sie das stereotaktische Instrument gründlich mit 70%igem Ethanol abwischen. Tauchen Sie das chirurgische Instrument in 70%iges Ethanol, um es zu sterilisieren.
- Schrubben Sie den Kopf des Welpen mit 70% Ethanol. Suchen Sie das Dreiecks-Lambda auf dem Schädel und markieren Sie das Lambda mit einem Markierungsstift. Richten Sie die Nadelspitze auf das Lambda und setzen Sie die anterior-posterioren (AP) und medial-lateralen (ML) Koordinaten auf Null.
- Bewegen Sie den Injektionsarm entsprechend den X- und Y-Koordinaten der Zielstelle an die Zielstelle. Für das Striatum von Welpen am postnatalen Tag (P) 2 sind die Koordinaten: AP, +2,4 mm vor dem Lambda; ML, ±1,0 mm lateral von der Mittellinie; dorsal-ventral (DV), -1,7 mm vom Schädel entfernt. Markieren Sie die Position des schnellen grünen Farbstoffs in der PE10-Tube mit einem Stift.
- Bringen Sie die 30G-Injektionsnadel langsam nach unten, um die Haut und den Schädel zu durchdringen, und führen Sie dann die Nadelspitze nach oben, bis sie an der Oberfläche des Schädels stoppt. Setzen Sie die DV-Koordinate auf Null.
- Bringen Sie die 30G-Injektionsnadel langsam nach unten, bis sie die DV-Koordinate der Zielstelle erreicht. Warten Sie 1 Minute, damit das Parenchym wieder seine normale Form annehmen kann. Führen Sie dann das Mikroinjektionsprogramm (100 nL/min) aus.
- Stellen Sie sicher, dass sich die Markierung des schnellen grünen Farbstoffs in der PE-Tube bewegt, um sicherzustellen, dass die Virusflüssigkeit in das Gehirn injiziert wird.
- Warten Sie 1 Minute nach Beendigung der Mikroinjektion und bringen Sie die Nadel dann langsam und schrittweise innerhalb von 30 s auf die Hälfte der Höhe der DV-Tiefe. Ziehen Sie nach 30 s die Nadel langsam aus dem Kopf des Welpen zurück.
2. Postoperative Genesung des Welpen
- Erwärmen Sie den Welpen 20 Minuten lang in einem 33 °C heißen Inkubator. Überprüfen Sie alle 5 Minuten, wie sich der Welpe von der Unterkühlungsanästhesie erholt hat, bis der Welpe wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
- Bringen Sie den Welpen zum Muttertier zurück, nachdem der Welpe vollständig geborgen ist.