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1. Bildgebung exotischer Ereignisse mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)
Hinweis: Dieses Protokoll erfordert spezielle Mikroskopiegeräte, einschließlich einer Klimakammer zur Aufrechterhaltung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Kohlendioxid (CO2), eines inversen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskops (TIRF), das mit einer Epifluoreszenzbeleuchtung ausgestattet ist, eines TIRF-Objektivs mit hoher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur (NA), eines automatisierten XYZ-Objektivs und ein empfindlicher CCD-Detektor (Charge-Coupled Device). Dieses Protokoll verwendet ein vollautomatisches inverses Mikroskop, das mit einem 100x 1,49 NA TIRF-Objektiv, einem Festkörperlaser mit 491 nm und einem elektronenmultiplizierenden CCD (EM-CCD) ausgestattet ist. Alle Geräte werden durch Bildgebungs- und Lasersteuerungssoftware gesteuert. Schalten Sie vor Beginn des Bildgebungsprotokolls die Klimakammer, den Tisch, die Lampe, den Computer und die Kamera ein.
- Wählen Sie das Objektiv in der Bildgebungssoftware aus. Sobald das Objektiv an seinem Platz ist, befestigen Sie die Objektivheizung um den Kragen.
- Vergewissern Sie sich, dass das Objektiv vollständig abgesenkt ist, bevor Sie den Bühneninkubator im Bühnenschlitz befestigen. Gießen Sie destilliertes Wasser gleichmäßig in die Einlässe des Inkubators, um ein Verschütten zu verhindern.
- Schalten Sie das Inkubationssystem ein. Öffnen Sie das Ventil zum CO2 -Tank und vergewissern Sie sich, dass der Druck gemäß den Anweisungen des Herstellers für das System geeignet ist. Lassen Sie die Kammer einige Zeit auf 5 % CO2 und 37 °C bringen. Stellen Sie vor dem Hinzufügen der Bildgebungsschale eine leere Schale in den Inkubator, um Wasserkondensation auf dem Objektiv zu vermeiden.
- Schalten Sie die Laserquelle ein.
- Öffnen Sie den Bühneninkubator und geben Sie Immersionsöl in die Linse. Legen Sie die Probe in den Inkubator und stabilisieren Sie sie mit Stabilitätsarmen oder einem Schalengewicht. Heben Sie das Objektiv an, bis das Öl mit dem Boden der Probe in Berührung kommt. Schalten Sie auf Durchlichtbeleuchtung um und finden Sie die neuronale Brennebene durch das Okular.
- Starten Sie die Lasersoftware und verbinden Sie sie mit der Lasersteuerungssoftware. Stellen Sie die Beleuchtung auf Weitfeld ein und wählen Sie das Objektiv aus (empfohlen wird 100x 1,49 NA TIRF). Stellen Sie den Brechungsindex der Probe ein (Zellen ~1,38). Stellen Sie die Laserintensität ein, indem Sie "TTL" (Transistor-Transistor Logic) für den 491-nm-Laser deaktivieren. Stellen Sie den Schieberegler auf 100 ein und senken Sie ihn dann wieder auf einen Wert zwischen 20 % und 40 %. Überprüfen Sie erneut "TTL".
- Fokussieren Sie die Probe erneut bei Durchlichtbeleuchtung. Gehen Sie zur Bildgebungssoftware, wählen Sie 491-nm-Laserbeleuchtung und öffnen Sie den Verschluss. Stellen Sie den Brennpunkt des Lasers an der Decke fein ein ein ein und zentrieren Sie ihn auf die Mitte der Blende mit geschlossenem Feld, wobei der Kondensor entfernt wird. Legen Sie den Kondensor kopfüber auf die optische Bank, um die Linse nicht zu zerkratzen.
- Tauschen Sie den Kondensator aus, gehen Sie zur TIRF-Software und stellen Sie die Eindringtiefe (PD) auf 110 nm ein. Wechseln Sie dann für die Bildgebung von der Weitfeldbeleuchtung in den TIRF-Beleuchtungsmodus.
- Finden Sie Vesikel-assoziiertes Membranprotein 2 (VAMP2)-Phluorin-exprimierende Zellen durch die Okulare mittels Weitfeld-Epifluoreszenz mit der Epifluoreszenzlichtquelle.
- Passen Sie die Bildgebungsparameter (Belichtungszeit, Verstärkung und Laserleistung) an, um das Signal-Rausch-Verhältnis und den Dynamikbereich zu maximieren, indem Sie die minimale Belichtungszeit und Laserintensität verwenden, um Photobleaching und Phototoxizität zu reduzieren (z. B. Belichtung zwischen 50 und 100 ms, mit einer Verstärkung von 15 - 30 bei 30% maximaler Laserleistung).
- Stellen Sie den kontinuierlichen Autofokus pro Zelle ein. Nehmen Sie ein Zeitrafferbild auf, das 5 Minuten lang alle 0,5 Sekunden aufgenommen wird. Für den Netrin-1-stimulierten Zustand geben Sie 500 ng/ml Netrin-1 in die Zellschale in einer Laminar-Flow-Haube und stellen Sie die Schale vor der Bildgebung für 1 Stunde in den Inkubator zurück.