Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung exozytärer Ereignisse

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Abstract

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Quelle: Winkle, C. C., et al. Unter Verwendung kombinierter Methoden zur Definition der Rolle der Plasmamembranabgabe während der Axonverzweigung und der neuronalen Morphogenese. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) zur Visualisierung exozytärer Ereignisse in kortikalen Neuronen. Ein pH-empfindlicher Marker für grün fluoreszierendes Protein (GFP) fluoresziert bei der Vesikelfusion, wobei die selektive TIRF-Anregung die membranproximale Exozytose in der Zeitrafferbildgebung erfasst.

Protocol

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1. Bildgebung exotischer Ereignisse mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Hinweis: Dieses Protokoll erfordert spezielle Mikroskopiegeräte, einschließlich einer Klimakammer zur Aufrechterhaltung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Kohlendioxid (CO₂), eines inversen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskops (TIRF), das mit einer Epifluoreszenzbeleuchtung ausgestattet ist, eines TIRF-Objektivs mit hoher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur (NA), eines automatisierten XYZ-Objektivs und ein empfindlicher CCD-Detektor (Charge-Coupled Device). Dieses Protokoll verwendet ein vollautomatisches inverses Mikroskop, das mit einem 100....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm Glasboden-Lebendzell-Bildgebungsschalen	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	Muss mit 1mg/mL Poly-D-Lysin beschichtet und vor dem Plattieren von Zellen gespült werden
Olympus IX81-ZDC2 inverses Mikroskop	Olympus
Lambda LS Xenonlampe	Sutter Instruments Unternehmen
Umweltbühne Top Inkubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF Objektiv	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Cell TIRF Steuerungssoftware	Olympus		Software zur Steuerung Laser für die TIRF-Bildgebung
Fidschi (Bild J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
Kaninchen polyklonal anti-human VAMP2	Zellsignalisierung	11829
Poly-D-Lysin	Sigma	p-7886	Gelöst in sterilem Wasser bei 1mg/mL

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