Hemmung der neuronalen Aktivität und deren elektrophysiologischer Nachweis bei einer Ratte

Zusammenfassung

Quelle:

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Montage der Aufnahme-Injektion Pipette

1. Ziehen Sie mit einem Pipettenabzieher an einer ca. 7 cm langen Glaskapillare (1 mm Außendurchmesser).
2. Brechen Sie die Spitze der Kapillare und überprüfen Sie die Öffnung unter einem Lichtmikroskop. Vergewissern Sie sich, dass der Innendurchmesser zwischen 30 μm und 40 μm liegt.
3. Führen Sie einen 7 cm langen Silberdraht in die Glaskapillare ein, wobei ca. 1 cm aus dem nicht konischen Ende der Glaspipette herausragt.
4. Biege das überschüssige Filament orthogonal zur Glaskapillare.
5. Tragen Sie ein Tröpfchen flexiblen Kunststoffkleber auf den Schaft einer 30 G Injektionsnadel auf.
6. Führen Sie eine 30 G Injektionsnadel in die Glaspipette ein, wie in Abbildung 1 dargestellt
.
7. Fügen Sie eine zweite Schicht Klebstoff hinzu, um eine ordnungsgemäße Abdichtung der Verbindung zwischen der Glaspipette und der Injektionsnadel zu gewährleisten.
8. Lassen Sie die Pipette mit der Spitze nach oben etwa 12 Stunden trocknen, um eine ordnungsgemäße Aushärtung des Klebers zu gewährleisten. Das fertige Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt.

HINWEIS: Dieses Verfahren wird bei akuten Experimenten durchgeführt und eine Sterilisation der Pipettenspitze ist nicht erforderlich.

2. Vorbereitung der Tiere

1. Setzen Sie die Ratte in eine Narkosebox.
2. Induzieren Sie eine Anästhesie mit 4% Isofluran für 5 bis 10 Minuten.
3. Legen Sie das Tier mit einem Heizkissen und einer Rektalsonde auf einen stereotaktischen Tisch, um eine Körpertemperatur von 37 °C zu halten. Verwenden Sie einen Nasenkonus, um die Anästhesie mit 2 % Isofluran aufrechtzuerhalten. Befestigen Sie den Rattenkopf mit Ohrstangen und einem Zahnhalter.
4. Tragen Sie Augensalbe oder Augentropfen auf, die 1% Atropintropfen enthalten, um die Pupillenerweiterung zu unterstützen. Um Trockenheit zu vermeiden, ca. alle 30 min Gleittropfen auftragen.
5. Rasieren Sie den Kopf und reinigen Sie ihn mit 10% Povidon-Jod.
6. Für die Lokalanästhesie injizieren Sie 0,5 ml 2% Lidocain an 2-3 Stellen unter die Kopfhaut, indem Sie die Haut anheben und die Nadelspitze einführen.
7. Bestätigen Sie ein angemessenes Maß an Anästhesie, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen und den Bewegungsmangel beobachten. Überwachen Sie außerdem die Herzfrequenz, um sicherzustellen, dass sie innerhalb der normalen Werte (300 bis 400 Schläge/min) liegt.
8. Schneiden Sie die Kopfhaut in einer geraden Linie entlang des Medians mit einer Skalpellklinge #10 ein, um sowohl die koronale als auch die sagittale Naht freizulegen.
9. Decken Sie die Lambda- und Bregma-Punkte auf, indem Sie das Gewebe, das den Schädel bedeckt, mit einem chirurgischen Spatel beiseite schieben.
10. Richten Sie den Schädel so aus, dass sich die Bregma- und Lambda-Positionen auf derselben Ebene befinden.
11. Um den Referenzpunkt einzustellen, verwenden Sie ein stereotaktisches Gerät mit einem montierten Glasrohr, um es direkt über Bregma zu platzieren. Dies ist die "Null" für die antero-posterioren und medial-lateralen Messkoordinaten.
12. Legen Sie den Point of Interest fest, indem Sie die stereotaktische Halterung auf die erforderlichen Koordinaten bewegen, notieren Sie sich die stereotaktischen Koordinaten und zeichnen Sie ein Quadrat um den Zielbereich, das die Stelle markiert, an der die Kraniotomie durchgeführt wird.
13. Verwenden Sie einen chirurgischen Bohrer mit einem sterilisierten Bohrer langsam und ohne Druck entlang des markierten Quadrats, um das Knochenmaterial langsam zu entfernen. Achten Sie darauf, nicht zu lange in denselben Bereich zu bohren, da dies Hitze erzeugt und Läsionen im Kortex verursacht.
14. Wenn der Knochen, der die Kraniotomie begrenzt, ausreichend dünn wird, entfernen Sie den Schädelabschnitt vorsichtig mit einer Pinzette, um die Rinde freizulegen.
15. Spülen Sie die freiliegende Hirnrinde häufig mit künstlichem Liquor, um eine Austrocknung des Gewebes zu verhindern.
    HINWEIS: Die Entfernung von Dura mater ist bei der Ratte nicht erforderlich, da die Spitze der Injektionsrode stabil genug ist, um einzudringen.

3. Befüllen und Montieren des Injektionssystems

1. Die 5-10 μl Mikrospritze durch Aspiration mit Mineralöl befüllen.
2. Füllen Sie die Injektionsnadel mit der festsitzenden Glaspipette mit einer Lösung aus 0,5 % Chicago Sky Blue (CSB) und 300 μM γ-Aminobuttersäure (GABA) oder einer Lösung von 2 % Lidocain mit 0,5 % CSB. Verdünnen Sie alle Lösungen mit Kochsalzlösung.
   1. Im Falle einer reichlich vorhandenen Substanz füllen Sie mit einer normalen Spritze und verwenden Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
   2. Bei teureren Substanzen wird die Injektionsrode mit Mineralöl gefüllt und das chemische Mittel kann dann durch Aspiration eingebracht werden. Da der Dichteunterschied zwischen Mineralöl und Wasser relativ groß ist, ist diese Substanz ein guter Kandidat für die Injektion von wässrigen Lösungen.
      HINWEIS: Ein Farbstoff kann zugesetzt werden, um die Trennung zwischen zwei Flüssigkeiten zu bestätigen.
3. Um die Injektionspipette zu füllen, füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit der Lösung durch Aspiration und injizieren Sie die Lösung dann langsam in die Injektionspipette.
4. Achten Sie sorgfältig auf Lecks in den in Abbildung 1 gezeigten Bereichen, indem Sie diese Bereiche sauber tupfen und Leckagen beobachten, indem Sie die Lösung langsam weiter mit der Spritze injizieren.
5. Entfernen Sie die 1-ml-Spritze. Achten Sie dabei darauf, leichten Druck auf den Kolben auszuüben, damit das Vakuum die Lösung nicht aus der Injektionspipette entfernt.
6. Füllen Sie die Mikrospritze durch Aspiration mit Mineralöl und befestigen Sie es fest an der gefüllten Injektionspipette, dann wischen Sie überschüssige Lösung vorsichtig mit Gaze von der zusammengesetzten Injektionsrode ab.
7. Vergewissern Sie sich, dass die Spitze nicht verstopft ist, indem Sie ein sehr kleines Volumen injizieren, das ausreicht, um zu sehen, wie sich ein kleiner Tropfen an der Spitze der Glaspipette bildet.
8. Montieren Sie die Injektionsrode an der Mikropumpenanlage und stellen Sie sicher, dass sie gut befestigt ist.
9. Positionieren Sie die Injektionsrodenspitze vorsichtig an den Zielkoordinaten und senken Sie die Spitze auf die Oberfläche des Kortex.
10. Die Injektionsrode wird mit dem stereotaktischen Apparat unter Verwendung der entsprechenden anatomischen Koordinaten langsam auf die Zielstruktur (in diesem Fall Colliculus superior) abgesenkt.
11. Decken Sie die freiliegende Rinde mit warmem Agar ab, um eine Austrocknung des Gewebes zu verhindern.

4. Injektion und reversible Inaktivierung

1. Stellen Sie die Mikroinjektionspumpe so ein, dass sie 400 bis 800 nl bei 40 nl/min einspritzt, und drücken Sie Run, um die Injektion zu starten. Beachten Sie, dass die Spike-Rate während der Injektion eine Verringerung zeigt.
   HINWEIS: Im Versuchsaufbau erholte sich die neuronale Aktivität innerhalb einer Stunde nach dem Ende der GABA-Verabreichung. Jedes kalibrierte mechanische Gerät kann verwendet werden, um Druck auf die Mikroinjektionsspritze auszuüben, um die Injektion durchzuführen.
2. Nach Erfassung der elektrophysiologischen Daten mit einer von der örtlichen Tierethikkommission zugelassenen Methode einschläfern.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Injektrodenbaugruppe. An der Aufnahme-Injektionspipette wird eine Mikrospritze (A) befestigt, die aus einer 30 G Injektionsnadel (B) besteht, die auf einen Silberdraht...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Einspritzpumpe (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
Injektionskonsole (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton Spritze	Hamliton	(80301) 701LT 10 μL SYR	Spritzen zwischen 5 und 10 μL verwendet
Gel-Cyanacrylat-Klebstoff	Krazy Glue KG86648R		Die Gelform lässt sich leichter auf den Schaft der 30G-Injektionsnadel auftragen
Glaspipetten	WPI	#TW100F-4	Dünnwandig, 1 mm Außendurchmesser, 0,75 mm ID mit verwendeten Filamentpipetten
720 Nadelpipettenabzieher		Kopf 720
Silberdraht	A-M Systems, Inc.	782500	Blank 0.010"