Subpiale Genverabreichung im Rückenmark der Maus zur Bewertung der Genexpression

Zusammenfassung

Quelle: Tadokoro, T., et al. Subpiale Adeno-assoziierte Virus 9 (AAV9) Vektorverabreichung bei erwachsenen Mäusen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt eine subpiale Injektionstechnik für die Genabgabe an das Rückenmark bei Mäusen. Das Verfahren umfasst die Freilegung der Dura mater, die Punktion der Pia mater und die Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV), das ein fluoreszierendes Protein-exprimierendes Gen trägt, in den subpialen Raum. Nach der Injektion und Genesung erleichtert das Virus die Genexpression in Rückenmarkszellen und ermöglicht so die Untersuchung der Zielgenexpression.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Allgemeine tierische und chirurgische Vorbereitung

1. Vor Beginn des chirurgischen Eingriffs das Virus auftauen (AAV9-UBI-GFP [UBI: Ubiquitin Promoter, GFP: Green Fluorescent Protein]; 5 μL Aliquote). Bereiten Sie eine 5%ige Dextranlösung (10.000 MW) her, indem Sie Dextranpulver in destilliertem Wasser mischen. Mischen Sie die Viruslösung mit 5%iger Dextranlösung 1:1 bis zu einer Enddextrankonzentration von 2,5%.
   1. Lagern Sie die Viruslösung auf Eis (4 °C).
2. Verwenden Sie adulte C57BL/6J-Mäuse (männlich und weiblich, 20-30 g). Betäuben Sie die Mäuse mit 5 % Isofluran (in O₂, 1 L/min) und halten Sie sie während der Operation bei 2-3 % inhaliertem Isofluran (in O₂, 1 L/min) per Nasenkonus, abhängig von der Atemfrequenz und der Pfotenklemmreaktion.
3. Rasieren Sie den Rücken der Tiere mit einer Schermaschine und reinigen Sie die Haut mit 2% Chlorhexidin.
4. Befolgen Sie in Studien zur chronischen Genesung eine streng sterile Technik.
5. Sollen lumbale subpiale Injektionen durchgeführt werden, ist die Haut über den Wirbeln Th8-L1 mit einem Skalpell zu durchtrennen und der Paravertebralmuskel mit einer Schere von den Wirbeln Th10-12 zu lösen.
   1. Setze das Tier mit Maus-Wirbelsäulenklemmen in einen standardmäßigen stereotaktischen Rahmen.
   2. Rasieren Sie beide Seiten der Lamina der Wirbel Th10-12 mit einem Zahnbohrer (Bohrer: 0,9 mm, Drehzahl: 20.000 U/min), bis Risse entstehen.
   3. Entfernen Sie rissige Knochenfragmente mit einer Pinzette und legen Sie die dorsale Oberfläche des lumbalen Rückenmarks frei.
   4. Schneiden Sie die Dura mit einer 30 G Edelstahlnadel und einer Pinzette ca. 1 cm auf.

2. Öffnen der Pial-Membran und Einsetzen der Subpial-Nadel für die AAV9-Verabreichung

1. Montieren Sie die 34-G-Pia-Durchdringungsnadel mit einem Glaskapillarhalter in den Z-Arm eines XYZ-Manipulators (Abbildung 1A und B).
   HINWEIS: Zur Herstellung der Pia-Eindringnadel wird die ursprüngliche abgeschrägte Spitze der 34G-Nadel mit einem Glaskapillarfasel mit Diamantschleifplatte - grob (5,0 μm bis 50 μm Spitze - geschärft und Schleifwinkel von 15 - 20°. Anschließend wird die Spitze der Nadel (1 mm Länge, gemessen von der Spitze) sanft um ca. 90° gebogen (Abbildung 1B, linkes Insert).
2. Mit einem chirurgischen Präparierfernrohr, das auf eine 8-10-fache Vergrößerung eingestellt ist, die Pia mit der Pia-penetrierenden Nadel um ca. 1 mm (Abbildung 1C) mit dem X-Arm durchdringen.
   1. Halte den Winkel der eindringenden Nadel zur Gewebeoberfläche bei 5-10°.
3. Entfernen Sie nach der Pia-Öffnung die Pia-penetrierende Nadel horizontal aus dem Subapialraum (Abbildung 1D) mit dem X-Arm.
   HINWEIS: Denken Sie daran, dass eine Orientierungsstelle, z. B. ein Blutgefäß, in die eingedrungen ist.
4. Beladen Sie eine stumpfe 36G-Injektionsnadel mit dem AAV9-UBI-GFP-Virus mit einer 50-μl-Mikrospritze, die mit der Injektionsnadel mit PE-10- oder PE-20-Schlauch verbunden ist.
5. Montieren Sie die Nadel mit einem Glaskapillarhalter (Abbildung 1B und rechter Einsatz) in den Z-Arm eines zweiten XYZ-Manipulators (Abbildung 1A und B).
   HINWEIS: Zur Herstellung der subpialen AAV9-Injektionsnadel wird die stumpfe Spitze einer 36-G-Nadel mit einer Glaskapillaranfasung mit Diamantschleifplatte - grob (Spitzengrößen 5,0 μm bis 50 μm) poliert, um die scharfen Kanten zu entfernen. Die Spitze der Nadel (2-3 mm Länge, gemessen von der Spitze) wird dann sanft auf ca. 90° gebogen. Die pia-penetrierenden und subpialen Injektionsnadeln werden in einen 1-2 cm langen 20G Slave-Edelstahlschlauch (10 mm ab dem Nadelende) eingeführt und mit Epoxidharz verklebt. Für eine sichere Befestigung am Glaskapillarhalter ist die Verwendung von 20 G (0,91 mm Durchmesser) Schlauch erforderlich.
6. Durch Manipulieren der X-, Y- und Z-Arme des zweiten Manipulators positionieren Sie die Spitze der AAV9-Injektionsnadel in die Pia-penetrierte Stelle und schieben Sie sie dann mit dem X-Arm etwa 2-3 mm in den subpialen Raum durch die vorherige Pialmembranöffnung vor ( Abbildung 1E und F).
   HINWEIS: 1) Das AAV9-UBI-GFP wird gemäß den zuvor berichteten Protokollen hergestellt, und die endgültigen Titer werden auf 1,2 x 10¹³ Genomkopien pro ml (gc/ml) angepasst. 2) Es ist nicht erforderlich, die Stelle der Pialöffnung zu markieren, da sie leicht identifizierbar ist (Abbildung 1D).
7. Injizieren Sie das AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 oder 5 μl) mit einer 50-μl-Mikrospritze in den subpialen Raum (siehe Tabelle 1 für Versuchsgruppen).
8. Entfernen Sie die Injektionsnadel aus dem subpialen Raum, nachdem die AAV9-UBI-GFP-Injektion abgeschlossen ist.
9. Verschließen Sie den Muskel und die Haut mit einer monofilen Naht 4.0 und chirurgischen Clips.
   HINWEIS: Der offene Wirbel muss nicht versiegelt werden.
10. Lassen Sie die Tiere sich auf einem Heizkissen erholen.
11. Zur Schmerzkontrolle injizieren Sie Buprenorphin 0,05 mg/kg/sc alle 12 Stunden für 2-3 Tage nach der Operation.

Tabelle 1: Experimentelle Gruppen. Alle Experimente wurden an adulten C57BL/6J-Mäusen durchgeführt.

Experimentelle Gruppen	Stelle/Ausmaß der AAV9-Verabreichung (*)	Volumen von AAV9 inj, Infusionsrate	Überlebenszeit	Gewebeanalyse
Gruppe A (n = 7)	C2 (bilateral)	5 μL/5 min	14 Tage	Gehirn + Rückenmark
Gruppe B (n = 12)	L1-L2 (bilateral)	1,5 μL oder 3μL, 60 sec/μL	14 Tage	Gehirn + Rückenmark
Gruppe C (n = 6)	C2 + L1-L2 (bilateral auf jeder Ebene)	5 μL/5 min	14 Tage	Rückenmark
* - bilateral = zwei subpiale Injektionen, eine in den rechten und eine in den linken subpialen Raum des/der injizierten Segmente(n) werden durchgeführt.

Ergebnisse

Abbildung 1: Versuchsaufbau zur Durchführung von subpialen Injektionen der Wirbelsäule bei einer erwachsenen Maus. (A) Zur Durchführung von spinalen subpialen Injektionen bei adulten Mäusen werden zwei separa...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C57BL/6J Mäuse	Jackson Labs	664
Laborstandard stereotaktisch für Mäuse	Harvard Apparat	72-9568
Maus Wirbelsäulenadapter	Harvard Apparat	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Manuelle Infusionspumpe	Stoelting	51218
34G abgeschrägte Nanofill-Nadel	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Blunt Nanofill-Nadel	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isofluran	MWI Veterinärbedarf	502017
Chlorhexidin-Lösung	MWI Veterinary Supply	501027
20G Edelstahlnadel	Becton-Dickinson	305175
23G Edelstahlnadel	Becton-Dickinson	305145
30G Edelstahl Nadel	Becton-Dickinson	305128
Baumwolle Applikator	MWI Veterinary Supply	27426
Glaskapillare Befader	Narishige International	SM-25B
Objektträgermikroskop Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Mikrospritze	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Schlauch	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Schlauch	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofile Naht	VetOne	V1D397
Glaskapillaranfaser	Narishige	Pipette Mikroschleifer EG-40
5 min Epoxid (Epoxid klar)	Devcon	14310
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory