Implantation eines Rückenmarksfensters in einer Maus für die In-vivo-Bildgebung

Zusammenfassung

Quelle: Pietruczyk, E. A., et al. Laminektomie und Implantation eines Rückenmarksfensters bei der Maus. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Implantation eines Rückenmarksfensters in eine anästhesierte Maus für die in vivo Bildgebung. Das Protokoll stabilisiert das freiliegende Rückenmark mit einem Borosilikat-Deckglas und einer 3D-gedruckten Rückplatte. Diese Methode ermöglicht die hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Dynamik der Blut-Hirn-Schranke und neurovaskuläre Wechselwirkungen zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Deckglas-Implantation

:

1. Tragen Sie vorsichtig ein 3 mm starkes Deckglas aus Borosilikatglas auf die freiliegende Nabelschnur auf.
2. Stellen Sie sicher, dass die Agarose auf 39 °C abgekühlt ist. Tragen Sie mit einem kleinen Spatel warme 2 % Agarose/aCSF (künstliche Zerebrospinalflüssigkeit) auf den Rand des Deckglases auf und lassen Sie sie durch Kapillarwirkung unter die Oberfläche ziehen.
   Hinweis: Bei Temperaturen unter 39 °C kann die Agarose zu gelieren beginnen. In diesem Fall mit einem Wasserbad oder der Mikrowelle aufwärmen. Einige Bediener ziehen es vor, zuerst einen Tropfen Agarose aufzutragen und das Deckglas darauf zu legen.
3. Gewebekleber auf die freiliegenden knöchernen Gelenkfortsätze der intakten Nachbarwirbel an der Brustwirbelsäule 11 und der Brustwirbelsäule 13 auftragen. Tragen Sie zusätzlichen Gewebekleber in einem Ring um die Laminektomiestelle, über die angrenzende Sehne und den Querfortsatz auf.
   Hinweis: In den folgenden Schritten ist Gewebekleber erforderlich, um eine korrekte Haftung auf dem Zahnzement zu gewährleisten. Die Gelenkfortsätze bilden einen natürlichen Sitz, auf dem die Rückenplatte stabil aufliegen kann (Abbildung 1). Die Adhäsion an den Gelenkfortsätzen bildet die stärksten Befestigungspunkte.
4. Mischen Sie Zahnzement mit Beschleuniger in einer Porzellanmischschale. Verwenden Sie einen kleinen Spatel, um Zahnzement auf die Gewebehaftschicht zu übertragen. Verwenden Sie Zahnzement, um die Rückplatte auf das Operationsfeld zu kleben, das mittig über dem Fenster liegt. Lassen Sie den Zahnzement 10 Minuten aushärten.
   Hinweis: Die feste Haftung der Rückenplatte an den vorderen und hinteren Gelenkfortsätzen sorgt für die grundlegende strukturelle Stabilität des Implantats.
5. Verwenden Sie zusätzlichen Zahnzement, um die innere Basis der Rückplatte und die Unterseite der Rückplatte zu füllen: Gewebeschnittstelle.
   Hinweis: Die zusätzliche Anwendung von Zahnzement verbessert die Haftung und verringert das Risiko eines Austretens von Mikroskopobjektiv-Tauchflüssigkeit (Kochsalzlösung) aus dem Boden der Rückplatte.
6. Schieben Sie den Gabelplattenhalter in die entsprechende Position über dem Fenster. Befestigen Sie die Rückplatte mit Schrauben in der Rückplattenhalterung.
   Hinweis: Für dieses Protokoll wurde ein speziell angefertigter Rückplattenhalter verwendet (Abbildung 2G\u2012H).
7. Tragen Sie Kochsalzlösung auf die Rückplatte auf, um sie auf Dichtheit zu prüfen. Wenn Flüssigkeit austritt, trocknen Sie den Bereich und tragen Sie mehr Zahnzement auf.

2. Vorbereitung der Bildgebung

1. Übertragen Sie das Tier auf die chirurgische Plattform auf den optischen Tisch.
   Hinweis: Unsere chirurgische Plattform, der Rückenplattenhalter und der Isofluran-Nasenkonushalter können als eine Einheit zwischen chirurgischen und Zwei-Photonen-Bildgebungsstationen transportiert werden, während eine kontinuierliche Isoflurananästhesie angewendet wird (Abbildung 2D, H). Ähnliche Einheiten können aus Haltegabeln, Balken und Stützpfeilern zusammengebaut werden, die bei kommerziellen Quellen (z. B. ThorLabs) erhältlich sind. Für die Intravitalmikroskopie sollte zwischen dem Mikroskopobjektiv und dem optischen Tisch ein Abstand von mindestens 11 Zoll vorhanden sein, um die Höhe der chirurgischen Plattform aufzunehmen.
2. Befestigen Sie die Operationsplattform mit einem Montagepfosten aus Edelstahl und einer gesenkten Klemmgabel auf dem optischen Tisch.
3. Tragen Sie frische Kochsalzlösung in die Vertiefung der Rückplatte auf. Senken Sie eine Wasser-Tauchlinse in die Vertiefung ab.
4. Verwenden Sie Durchlicht- oder Epifluoreszenzlicht, um den interessierenden Bereich und den Fokus zu identifizieren. Wechseln Sie in den Laserscanning-Modus und führen Sie eine In-vivo-Bildgebung gemäß der geeigneten Zwei-Photonen-Laseranregungswellenlänge, dichroitischen und Bandpassfiltern für die im Gewebe vorhandenen Fluorophore durch6.

Ergebnisse

Abbildung 1. Schematische Darstellung der anatomischen Platzierung des Rückenmarksfensters. A) Schematische Darstellung der superioren Ansicht eines unteren Brustwirbelkörpers, des Dornfortsatzes und des Rückenmarkssegments ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3D-gedruckte ovale Rückplatte	benutzerdefiniert		Stabilisierendes Bildgebungsfeld
Chirurgisches Präpariermikroskop	Leica	M205 C	Ausgestattet mit Leica FusionOptics, Planapo 0,63x M-Serie Objektiv und Gleittisch
Mikroskopkamera	Leica	MC170	HD Farbkamera zur Visualisierung des Operationsfeldes
Gleittisch	Leica	10446301	Der Gleittisch besteht aus zwei Metallplatten. Die Grundplatte ist fixiert. Die obere Platte gleitet auf einer gefetteten Schnittstelle, um eine rotierende und lineare Bewegung zu ermöglichen.
Chirurgische Station und Stabilisierungsgabel	Whale Manufactoring	kundenspezifische	Laminektomie
SomnoSuite Low-Flow-Isofluran-Verabreichungseinheit	Kent Scientific	SS-01	Chirurgische Anästhesieverabreichung mit integriertem digitalem Verdampfer
1,5-Zoll-Montagepfosten aus Edelstahl	ThorLabs	P50/M	Zur Montage der Operationsstation auf einem optischen Tisch für die Zwei-Photonen-Bildgebung
Senkgabel für 1,5"-Montage Pfosten	ThorLabs	PF175	Zur Stabilisierung der Operationsstation Halterung auf optischem Tisch für die Zwei-Photonen-Bildgebung
Idealer Knochen-Mikrobohrer	Harvard-Gerät	72-6065	Ausdünnung des Knochens für die Laminektomie
Wasserbad	Fisher Scientific	15-462-10	Wärmende Kochsalzlösung
Kauterpistole	FST	18010-00	Kauterisieren kleinerer Blutungen
Heizkissen	Benchmark	BF11222	1,9" x 4,5" Silikonheizung mit 20" Teflonleitungen, 10W, 5V
K Typ thermogekoppelte Rektumsonde	Physitemp	RET3	Messung der Körpertemperatur der Maus
Vaseline	Sigma	8009-03-08	Schmierende Rektumsonde
Feedback-geregelter Thermoregler	kundenspezifisch	NA	Zu den im Handel erhältlichen Alternativen gehören die Physitemp TCAT-Serie
PVA Chirurgische Augenspeere	Biber-visitec international	40400-8	Absorbierendes Blut
Elektrischer Trimmer	Wahl	41590-0438	Trimmen von Mausfell
Klinge, #11	FST	14002-14	Chirurgisches Werkzeug
Pinzette, #5	FST	11254-20	Chirurgisches Werkzeug
Pinzette, #4	FST	14002-14	Chirurgisches Werkzeug
Titatnium-Zahnzange	WPI	555047FT	Chirurgisches Werkzeug
Titan-Iris-Schere	WPI	555562S	Chirurgisches Werkzeug
Vetbond Gewebekleber	3M	084-1469SB	Vorbereitung der Gewebeoberfläche für dentales
Acryl Keramikmischtablett	Jack Richeson	420716	Mischen von zahnärztlichem Acrylmittel mit Beschleuniger
Orthojet Dental-Acryl	Lang Dental	1520BLK, 1503BLK	Dauerhafte Bindung der Rückplatte an das Gewebe
Kleines rundes Deckglas, #1 Dicke, 3 mm	Harvard-Gerät	64-0720	optisches Fenster
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	Für aCSF
KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	Für aCSF
Glucose	Fisher Scientific	50-99-7	Für aCSF
HEPES	Sigma	7365-45-9	Für aCSF
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	7791-18-6	Für aCSF
CaCl₂·2H₂O	Fisher Scientific style='text-align:center;'>#################	Für aCSF
Carprofen	Rimadyl	QM01AE91	Analgesie
Bakteriostatisches Wasser	Henry Schein	2587428	Verdünnungsmittel für Carprofen
Isofluran	Henry Schein	11695-6776-2	Anästhesie
Laktat-Ringerlösung	Baxter	0338-0117-04	Hydratation für Maus
Agarose High	EEO Sigma	A9793	Gelpunkt 34-37 Grad C
Augenfeuchte Schmiersalbe	Akwa Tränen	68788-0697	Verhindern Sie das Austrocknen der Hornhaut
MOM Zwei-Photonen-Mikroskop	Sutter