Echtzeit-Überwachung der Genexpression in Hirnschnitten mittels dreidimensionaler Bildgebung

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Shimojo, H., et al. Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der Neurogenese von Mäusen. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video werden kortikale Schnittkulturen aus transgenen Mausembryonen verwendet, um die Genexpression durch dreidimensionale Bildgebung zu überwachen. Biolumineszenz-, Fluoreszenz- und Hellfeldbilder werden verwendet, um die Echtzeit-Genexpression während der neuronalen Differenzierung innerhalb des nativen Gewebes zu visualisieren.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

Visualisierung der Expression von Luciferase-Reportern in Slice-Kulturen
1. Starten Sie das Lumineszenz-Live-Imaging-System, bevor Sie mit der Dissektion beginnen. Für kortikale Schnittkulturen sind folgende Bedingungen anzuwenden: 40 % O₂, 5 % CO₂ und 37 °C.
2. Tragen Sie das Immersionsöl auf die 40x Objektivlinse auf. Stellen Sie die Probenschale auf den Mikroskoptisch. Erfassen Sie das Fluoreszenz-Testbild und stellen Sie die Position und die Fokusebene auf den interessierenden Bereich unter Beleuchtung des Anregungslichts ein.
3. Führen Sie die Zeitraffererfassung durch 3-dimensionale Erfassungen (Lumineszenz, Fluoreszenz und Hellfeld) für 24 Stunden durch (Abbildung 1F-H). Verwenden Sie für die Lumineszenzbildaufnahme die folgenden Kameraeinstellungen: niedrige Übertragungsrate (50 kHz), 2x2/4x4 Binning, 10 min/5 min Belichtungszeit. Verwenden Sie für die Fluoreszenz- und Hellfeldbildaufnahme die folgenden Einstellungen: mittlere Übertragungsrate (1 MHz), 1x1-Binning und 100 ms Belichtungszeit.

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Ergebnisse

Abbildung 1: Herstellung der kortikalen Schnitte des embryonalen Telencephalons und Visualisierung der Dll1-Proteindynamik in den kortikalen Schnittkulturen. (A) Überprüfung der Expression von EGFP mit einem stereoskopischen Fluoreszenzmikros...