Verkapselung des Nervenwachstumsfaktors in Nanopartikeln mit hoher Dichte, die Lipoproteine imitieren

Zusammenfassung

Quelle: Zhu, J., et. al., Vorbereitung und Charakterisierung neuartiger HDL-imitierender Nanopartikel für die Verkapselung des Nervenwachstumsfaktors. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt den schrittweisen Zusammenbau von NGF-beladenen HDL-imitierenden Nanopartikeln unter Verwendung von Protamin-unterstützter Verkapselung und lipidbasierter Selbstorganisation für potenzielle neurotrophe Verabreichungsanwendungen.

Protokoll

1. Herstellung von NGF HDL-imitierenden Nanopartikeln

Die

1. Hilfsstoffe Phosphatidylcholin (PC), Sphingomyelin (SM), Phosphatidylserin (PS), Cholesteryloleat (CO) und D-α-Tocopherylpolyethylenglykolsuccinat (TPGS) werden in Ethanol gelöst, um Stammlösungen in einer Menge von 1 mg/ml herzustellen.
   HINWEIS: Die Stammlösungen wurden aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Das Cholesteryloleat wurde in dunklen Flaschen gelagert. Die PC-, SM-, PS- und CO-Stammlösungen waren bis zu 6, 3, 12 bzw. 12 Monate bei -20 °C stabil. Die TPGS-Lösung war mindestens 12 Monate bei -20 °C stabil.
2. Mischen Sie 10 μl NGF (1 mg/ml in Wasser) mit 10 μl Protamin USP (1 mg/ml in Wasser) in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um den Komplex zu bilden.
   HINWEIS: Die NGF- und Protamin-Stammlösungen wurden aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen wird für die NGF-Stamm nicht empfohlen.
3. Geben Sie 59 μl PC, 11 μl SM, 4 μl PS, 15 μl CO und 45 μl TPGS in ein Glasfläschchen. Mischen und verdampfen Sie das Ethanol unter einem sanften Stickstoffstrom für ca. 5 min; Alle sonstigen Bestandteile sollten einen öligen, dünnen Film am Boden des Glasfläschchens bilden.
4. Geben Sie 1 ml ultrareines Wasser (Typ 1) in das Fläschchen und homogenisieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 9.500 U/min (8.600 x g), um die Prototyp-Nanopartikel (NPs) zu bilden.
5. Den in Schritt 1.2 hergestellten Komplex zu den Prototyp-NPs geben und 30 min lang bei 37 °C unter Rühren unter Verwendung eines kleinen Rührstabs im Glasfläschchen inkubieren.
6. Die NPs durch Rühren bei Raumtemperatur weitere 30 min abkühlen lassen. Nach dem Abkühlen 106 μl Apo A-I (1,49 mg/ml) hinzufügen und über Nacht bei Raumtemperatur umrühren, um die endgültigen NGF-HDL-ähnlichen NPs zu bilden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rekombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-a-Phosphatidylcholin (PC)	Avanti	131601P	95%, Ei, Huhn
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Gehirn,
Schweinephosphatidylserin (PS)	Avanti	840032P	Gehirn,
Schweinecholesteryloleat (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopherylpolyethylenglykolsuccinat (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylenglykolsuccinat,
Protaminsulfat	Sigma	P3369	erfüllt die USP-Testspezifikationen
Apolipoprotein A1, Humanplasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1mg in 671 μl 10 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,4
Homogenisator	Tekmar	T 25-S1
Polytron Homogenisator	Kinematica	PT 1200C