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1. Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus
- Vor der Kennzeichnung Reaktion zu reinigen Dengue-Virus mit Saccharose-Kissen und bereiten die notwendigen Reagenzien und Geräte wie im Protokoll angegeben.
- Bereiten Sie frische 0,2 M Natriumbicarbonat-Puffer, pH 8,5 (Kennzeichnung Puffer) und 1,5 M Hydroxylamin, pH 8,3 (Stop-Reagenz), kurz bevor die Kennzeichnung und Filter mit 0,2 um Spritzenfilter sterilisieren.
- Verdünnen Sie ca. 3x10 8 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) von gereinigtem Dengue-Virus in 1 ml Kennzeichnung Puffer in einem 2 ml Tube. Dies kann anteilig für Batch-Kennzeichnung von Virus skaliert.
- Das lyophilisierte Alexa Fluor 594 (AF594) Succinimidylestern bis 1mm in der Kennzeichnung Puffer unmittelbar vor der Etikettierung Reaktion. Andere Fluorochrome aus der Alexa Fluor Farbstoff-Serie können je nach eigenen Bedürfnissen eingesetzt werden. Minimierung der Exposition gegenüber von diesem Schritt ab Licht.
- Add 100 &mgr; der 1mM AF594 Farbstoff der verdünnten Virus unter leichtem Rühren mit der Pipettenspitze.
- Inkubieren Sie die Kennzeichnung Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 1 Stunde im Dunkeln. Mix von sanften Kipps alle 15 Minuten.
- Drehen Sie das Rohr kurz in einer Tischzentrifuge und fügen 100 &mgr; von Stop-Reagenz, um die Reaktion Mischung unter leichtem Rühren mit der Pipettenspitze.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für eine Stunde im Dunkeln. Mix von sanften Kipps alle 15 Minuten.
2. Purifying Alexa Fluor markierte Dengue-Virus
- In der Zwischenzeit Gleichgewicht der Reinigung Säule mit Puffer der Wahl. In diesem Versuch wird ein PD-10 Säule mit 25 ml HNE-Puffer (5 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA), pH 7,4, vor Gebrauch.
- Übernehmen der markierten Virus an die Spitze der Säule und sammeln Sie die Flow-Through einmal die markierten Virus in der Matrix. Füllen Sie die Spalte mit HNE-Puffer, wenn alle markierten Virus der Matrix eingetragen hat. Verwerfen Sie den ersten 2,5 ml Flow-Through und sammeln Sie die nächsten 2 ml des markierten Virusfraktion.
- Aliquotieren und lagern gereinigt AF594 gekennzeichnet Dengue-Virus in -80 ° C, weit weg von der Lichtquelle.
- Tauwetter ein Aliquot und bestimmen den Titer der markierten Virus durch Plaque-Assay bevor Sie das Batch-markierter Virus.
- Seed 5x10 4 pro Vertiefung von Vero-Zellen, in M-199 Wachstumsmedium, in einem 4-Well-Platte mit einem Deckglas auf dem Boden des gut einen Tag vor der Infektion.
- Entfernen Sie den Kulturüberstand in gut und infizieren die Zellen mit Multiplizität der Infektion von 1 des markierten Virus in 100 &mgr; l Volumen (verdünnt in M-199 Wartungs-Medium bei Bedarf) für 10min bei 37 ° C.
- Entfernen Sie die Impfkulturen und waschen Sie die Deckgläser zweimal in 1xPBS.
- Fix die Zellen in 3% paraformalydehyde für 30 Minuten.
- Waschen Sie die Deckgläschen 3 mal in 1xPBS.
- Permeabilisieren die Zellen mit Permeabilisierung Lösung mit 0,1% Saponin und 5% BSA in 1xPBS für 30 Minuten.
- Inkubieren Sie die Zellen mit unverdünntem Zentrifugation-geklärte Überstand von 3H5 monoklonaler Antikörper Hybridom-Kultur für 1 Stunde in einer feuchten Kammer, vor Licht geschützt.
- Waschen Sie die Deckgläschen 3 mal in Waschpuffer (1xPBS mit 1mM Calciumchlorid, 1 mM Magnesiumchlorid und 0,1% Saponin).
- Inkubieren Sie die Zellen mit AF488 Anti-Maus-IgG-Antikörper, 1:100 in Permeabilisierung Lösung verdünnt, für 45 Minuten in feuchten Kammer, vor Licht geschützt.
- Waschen Sie die Deckgläschen 3 mal in Waschpuffer und spülen Sie einmal in deionisiertem Wasser.
- Dab den Rand des Deckglases gegen ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser abtropfen lassen und Montage auf Glasträger mit 8μl Mowiol 4-88 mit 2,5% Dabco.
- Lassen Sie die Montage-Lösung über Nacht eingestellt bei 4 ° C vor der Anzeige mit einem Zeiss-konfokalen Mikroskop. Sequential Akquisitionen sollte spannend Fluorophor in einer Zeit, und das Umschalten zwischen den Detektoren gleichzeitig durchgeführt werden.
- Die Bilder werden dann für die Co-Lokalisierung des E-Proteins Antikörper-Färbung mit den markierten Virus mit dem Zeiss LSM Zen-Software auf den Grad der Kennzeichnung Schätzung analysiert.
3. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für die Ausbeute an Dengue-Virus mit AF594 Farbstoff markiert ist in Abbildung 2 dargestellt. Normalerweise sollte weniger als 10-fach Drop von der ersten Titer nach erfolgreicher Kennzeichnung eingehalten werden. Allerdings ist anzumerken, dass alle Puffer bereit für die Kennzeichnung, erfolgreich zu sein und die Alexa Fluor Succinimidylestern sollte sofort nach der Rekonstitution verwendet werden, da sie hydrolysieren in reaktiven freien Säuren in wässrigen Lösungen 8 frische werden müssen.
Als nächstes muss der markierten Virus, um eine ausreichende Fluoreszenz vor der Verwendung in Experimenten überprüft werden. Eine einfache Immunfluoreszenztest auf Vero-Zellen durchgeführt und der Grad der Etikettierung können von der Co-Lokalisation des markierten Virus mit Anti-E-Protein Antikörper-Färbung abgeschätzt werden. Trennenal-Zellen wurden untersucht und eine typische konfokale Abbildung ist in Abbildung 3 dargestellt. Co-Lokalisation Analyse der Bilder mit der LSM Software Zen gezeigt überlappen Koeffizienten zwischen 0,65 bis 0,8, was darauf hindeutet, dass etwa 65 bis 80% der Virionen mit dem Farbstoff markiert wurden.
Abbildung 1.Die Schema der Darstellung der Alexa Fluor Farbstoff Kennzeichnung von Dengue-Virus Verfahren. Erstens, die relevant Puffer und gereinigt Dengue-Virus vorbereitet sind. Die Alexa Fluor Farbstoff rekonstituiert und hinzugefügt, um die Dengue-Virus in der Kennzeichnung verdünnt. Die Reaktion wird dann 1 Stunde später mit der Zugabe von Stop-Reagenz beendet. Anschließend wird der markierte Virus durch eine Größenausschluss-Säule gereinigt, um freie Farbstoff zu entfernen. Schließlich ist die Bezeichnung Virus durch Plaque-Assay erneut titriert und getestet für die Fluoreszenz.
Abbildung 2. Mittlere Anzahl der lebensfähigen Virionen (pfu / ml) als auf einem Plaque-Assay vor und nach AF594 Kennzeichnung bestimmt. Ein Aliquot des AF594 gekennzeichnet Dengue-Virus wird aufgetaut und wieder titriert mittels Plaque-Assay und es zeigt typischerweise weniger als 10-fach Drop aus der Ausgangspunkt Titer. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von Duplikaten.
Abbildung 3. Co-Lokalisation von AF594 Etiketten mit Dengue-Virus E-Proteine in Vero-Zellen. Zellen auf Deckgläsern gewachsen Vortag wurden mit AF594 gekennzeichnet Dengue bei MOI von 1 für 10 Minuten bei 37 ° C infiziert Anschließend wurden die Zellen fixiert und mit anti-E-Antikörper, untersucht und für Kolokalisation von E-Protein (grün) und AF594 Kennzeichnung (rot). Fluoreszenzsignale wurden visualisiert unter 63X Vergrößerung mit Zeiss LSM 710 konfokalen Mikroskop. Scale-Bar ist 10 um. Gelb zeigen Bereiche von Kolokalisation, wie im Kasten dargestellt.