Intravenöse Verabreichung von Rezeptorblockern zur Verringerung von Hirnödemen in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Zeynalov, E. et. al., Continuous IV Infusion is the Choice Treatment Route for Arginin-Vasopressin Receptor Blocker Conivaptan in Mäusen zur Untersuchung von Schlaganfall-evozierten Hirnödemen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die intravenöse Verabreichung eines Arginin-Vasopressin (AVP)-Rezeptor-Antagonisten in einem Mausmodell. Ein vorübergehender Verschluss der mittleren Hirnarterie führt zu Hirnödemen. Ein AVP-Rezeptor-Antagonist wird über einen Katheter in die linke Halsvene verabreicht, um das Ödem zu lindern.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. In Vivo Schlaganfall-Induktion

1. Beschichten Sie das Filament vor der Operation mit Zahnharz.
   1. Schneiden Sie ein 12 mm langes Stück Filament aus einer 7-0 Nylonnaht ab. Mischen Sie 2 Teile des Harzes mit 1 Teil des Härters und tauchen Sie dann sofort die Spitze des Filaments in die Mischung, um etwa 1/3 der gesamten Länge zu bedecken. Entfernen Sie es schnell und vergewissern Sie sich, dass es mit einer glatten Oberfläche aus Zahnharz bedeckt ist.
   2. Trockne das Filament vor der Verwendung 2 Stunden lang an der Luft.
2. Setzen Sie die Maus in eine Anästhesie-Induktionskammer (2 l Volumen) und stellen Sie den Durchfluss von 1,5 % Isofluran in 25 % sauerstoffangereicherter Raumluft auf 2 l/min ein, der in die Kammer gelangt
.
3. Lassen Sie die Maus in der Induktionskammer bleiben, bis sie vollständig anästhesiert ist, was durch die mangelnde Reaktion auf das Einklemmen des Schwanzes bestimmt wird.
4. Legen Sie die Maus mit einem beheizten Pad auf den Operationstisch und stellen Sie die Isoflurankonzentration auf 1 % ein, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, die spontan durch den Nasenkonus verabreicht wird.
5. Schneiden Sie die Haare an der Vorder- und Rückseite des Nackens ab und besprühen Sie den Hals mit Reinigungsalkohol. Tragen Sie veterinärmedizinische Augensalbe auf beide Augen auf.
6. Um die Körpertemperatur kontinuierlich zu überwachen, verwenden Sie während der Operation einen rektalen Temperaturfühler, der mit einer Digitalanzeige verbunden ist.
7. Bringen Sie die Maus in Rückenlage, tragen Sie Povidon-Jod 10%ige Peelinglösung zur Desinfektion auf, decken Sie sie mit einem sterilen Tuch ab und machen Sie dann mit einer chirurgischen Skalpellklinge der Größe 10 einen Mittelschnitt entlang des Halses.
8. Ligatur der linken Arteria carotis communis (CCA) vorübergehend mit einer 6.0 Seidennaht.
9. Legen Sie ein weiteres Band an die linke Arteria carotis externa (ECA).
10. Platzieren Sie einen mikrovaskulären Clip auf der Arteria carotis interna (ICA).
11. Schneiden Sie mit einer mikrovaskulären Schere ein kleines Loch in die äußere Halsschlagader. Führen Sie ein Filament aus 7-0 Nylon, das mit Zahnharz beschichtet ist, in die Öffnung in der ECA ein und schieben Sie es kopfförmig vor, während Sie den Clip entfernen, bis ein Widerstand zu spüren ist (ca. 5-7 mm vom Bifurkationspunkt der CCA entfernt).
12. Lege ein provisorisches Band auf die Arteria carotis interna, um das Filament in Position zu halten. Siehe Diagramm in Abbildung 1A. Verschließen Sie die Haut mit einer Seidennaht und infiltrieren Sie die Wunde an der Vorderseite des Halses mit 0,2 ml 0,5% Bupivacain, wie in Schritt 2.6.
13. Lassen Sie die Maus 60 Minuten lang aus der Narkose erwachen und das Bewusstsein in einer Erholungskammer wiedererlangen. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
14. Testen Sie die Maus auf neurologisches Defizit-Scoring (NDS) wie folgt: 0 = normale motorische Funktion, 1 = Beugung des Rumpfes und der kontralateralen Vordergliedmaße beim Heckheben, 2 = Kreisen zur kontralateralen Seite, aber normale Haltung in Ruhe, 3 = Lehnen zur kontralateralen Seite in Ruhe, 4 = keine spontane motorische Aktivität.
    1. Für den NDS-Test heben Sie die Maus am Schwanz an und legen Sie sie zur Beobachtung (2-3 min) auf eine ebene Fläche. Alternativ können Sie Mäuse in der Auffangkammer beobachten. Mäuse, die einen NDS-Wert von weniger als 2 aufweisen, sind aufgrund eines unzureichenden Verschlusses der Arteria carotis media (MCA) aus dem Experiment auszuschließen.
       HINWEIS: Die Laser-Doppler-Flowmetrie kann verwendet werden, um den MCA-Verschluss zu bestätigen.
15. Betäuben Sie das Tier nach 60 Minuten Genesung in der Induktionskammer wie oben beschrieben, sterilisieren Sie den vorherigen Hautschnitt erneut mit 10% iger Povidon-Jod-Peelinglösung und öffnen Sie die Operationswunde an der Vorderseite des Halses wieder, indem Sie die Seidennaht durchtrennen und entfernen.
16. Um das Filament aus dem ECA zu entfernen, führen Sie die folgenden Schritte aus:
    1. Platzieren Sie einen mikrovaskulären Clip auf dem ICA. Löse die Naht am ICA und ziehe das Filament heraus, während du den Clip offen hältst.
    2. Schließen Sie den Clip und legen Sie eine Krawatte proximal zum Schnitt auf den ECA.
    3. Entfernen Sie den Clip und die Ligatur aus dem CCA, um die Durchblutung des Gehirns wiederherzustellen. Siehe Diagramm in Abbildung 1B.

2. Einführung eines intravenösen (IV) Katheters in die Halsvene für eine kontinuierliche Behandlung von 48 Stunden

HINWEIS: Fahren Sie unmittelbar nach Schritt 1.16.3 mit der Installation des Katheters fort, ohne die Maus zu wecken.

1. Verwenden Sie zwei verschiedene Größen von flexiblen Schläuchen: Führen Sie den Innenschlauch (0,94 mm Außendurchmesser; um das zu infundierende Medikament aufzunehmen) in den Außenschlauch (3,18 mm Außendurchmesser; zum Schutz des Innenschlauchs) ein.
2. Bringen Sie die Maus in Bauchlage, tragen Sie 10 % ige Povidon-Jod-Peelinglösung zur Desinfektion auf und machen Sie mit einer chirurgischen Skalpellklinge der Größe 10 einen 1 cm langen Schnitt im Nacken. Drehen Sie die Maus in die Rückenlage, sterilisieren Sie die Vorderseite des Halses erneut mit 10%iger Povidon-Jod-Peelinglösung und öffnen Sie die Operationswunde an der Vorderseite des Halses wieder. Tunneln Sie den Schlauch unter der Haut von dem Schnitt auf der Rückseite bis zur Vorderseite des Halses und ziehen Sie ihn von der offenen Wunde 1 cm nach außen.
3. Entfernen Sie das subkutane Fettgewebe von der linken Seite der Vorderseite des Halses etwa 1 cm lateral von der Mittellinie. Lokalisieren Sie die linke Halsvene, legen Sie zwei Binder im Abstand von 5 mm entlang der Vene und dehnen Sie die Vene leicht. Machen Sie mit einer mikrovaskulären Schere ein kleines Loch in die Halsvene zwischen den beiden Bändern. Führen Sie die Spitze des Schlauchs 5 mm tief nach caudal (in Richtung Herz) ein.
4. Befestigen Sie den Schlauch mit beiden Bändern an der Halsvene. Verschließen Sie die Haut an der Vorderseite des Halses mit einer 3-0 Seidennaht. Siehe Diagramm in Abbildung 1C.
5. Befestigen Sie den Schlauch mit einer Naht an der Haut im Nacken und verbinden Sie den Schlauch über einen Drehgelenk mit einer Mikroinfusions-IV-Pumpe. Der Drehgelenk ermöglicht die freie Bewegung der Mäuse im Käfig mit vollem Zugang zu Futter und Wasser.
6. Infiltrieren Sie die Hautschnitte an der Vorder- und Rückseite des Halses mit 0,2 ml 0,5 % Bupivacain, um postoperative Schmerzen zu vermeiden.
   HINWEIS: Abhängig von den institutsspezifischen Tierprotokollen können Tiere prä- und postoperativ mit Opioiden, nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAIDs) oder Antibiotika behandelt werden. Die genannten Behandlungen können jedoch die Ergebnisse des ischämischen Schlaganfalls verändern.
7. Lassen Sie das Tier in der Aufwachkammer erwachen und halten Sie es dann bis zum Endpunkt des Versuchs in einem separaten Käfig unter. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
8. Stellen Sie die Infusionsrate für eine kontinuierliche intravenöse Behandlung von Conivaptan über 48 Stunden (0,14 mg/ml in 5 % Dextrose) oder Vehikel auf 1,5 ml/kg/h ein und starten Sie die Infusion.
   HINWEIS: Die Gesamtmenge an intravenös infundiertem Conivaptan sollte ungefähr 0,2 mg/Maus/Tag bei einem Gesamtvolumen von 1,44 ml betragen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Diagramm des experimentellen Schlaganfallmodells, der IV-Katheterinstallation und des repräsentativen Infarktvolumens 48 Stunden nach dem Schlaganfall. Position des mit Harz vorbeschichteten Filaments (grün) in der linken Art...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Beheiztes Pad	K&H Manufacturing Inc	1060
Temperaturmonitor mit Rektalsonde	Physitemp	7029
Seidennahtspule, 6-0	Surgical Specialties Corporation	SP114
Seidennaht auf einer Nadel, 3-0	Ethicon	1684G
Nylonnaht, 7-0	Ethicon	1696G
Dentalharz Polysiloxan mit Härter	Heraeus Kulzer	65817930
Microinfusion IV Pumpe	Kent Scietific	GT0897
Swivel 22GA	Instech	375/22PS
Laborschlauch, 0,94 x 0,51 mm	Dow Corning	508-002
Laborschlauch, 3,18 x 1,98 mm	Dow Corning	508-009