Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Injektion von Reprogrammierungsfaktoren in das Gehirn
- Tieraufbau, stereotaktische Platzierung und BohrungHINWEIS: Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von Ascl1, Lmx1a und Nurr1 (ALN) für die Reprogrammierung von NG2 (Neuron-Glial Antigen 2) Gliazellen in Interneuronen. Unserer Erfahrung nach können Interneurone eines ähnlichen Phänotyps mit anderen Faktorkombinationen erhalten werden
- Bewegen Sie den M/L-D/V-Arm des stereotaktischen Rahmens an seinen Platz (über dem Tier) und befestigen Sie ihn.
HINWEIS: Der stereotaktische Rahmen ermöglicht die Einstellung der Spritze entlang der anterioren/posterioren (A/P, Y-Achse), medial/lateral (M/L, X-Achse), und dorsal/ventrale Achse (D/V, Z-Achse). - Bewegen Sie die Spritze entlang der verschiedenen Achsen des stereotaktischen Rahmens, um die Spitze der Glaskapillare knapp über das Bregma (den Verbindungspunkt, an dem sich die verschiedenen Schädelplatten treffen) zu bringen.
- Stellen Sie sicher, dass die Kapillarspitze sowohl in der A/P- als auch in der M/L-Ebene perfekt gerade ist. Im Falle eines mehrdeutigen Bregmas nehmen Sie den Durchschnitt der Nähte an der lateralen und mittleren Linie.
- Wenn die Spitze der Kapillare korrekt über dem Bregma platziert ist, setzen Sie sowohl die M/L- als auch die A/P-Werte auf dem digitalen Koordinatenzähler auf 0,0 zurück.
- Um sicherzustellen, dass sich der Kopf des Tieres in einer perfekt flachen Position befindet, verwenden Sie den digitalen Koordinatenzähler, um den D/V-Koordinatenwert zu messen, wenn der A/P-Arm bei +2,0 und -2,0 (M/L = 0,0) liegt, sowie wenn der M/L-Arm bei +2,0 und -2,0 (A/P = 0,0) liegt. Passen Sie die Höhe des Zahnbügels und der Ohrbügel entsprechend an.
- Bewegen Sie die Spritze auf die gewünschten Koordinaten für die Injektion von viralen Vektoren in das Striatum (A/P = +1,0; M/L = -2,0, relativ zu Bregma).
- Heben Sie die Spritze leicht an und bohren Sie durch das Mikroskop auf die Injektionsstelle ein Loch mit einem Zahnbohrer an den Injektionskoordinaten. Beginnen Sie mit dem Bohren an der Stelle und arbeiten Sie dabei in kreisförmiger und sanfter Weise.
HINWEIS: Üben Sie nicht zu viel Druck nach unten aus, da der Bohrer scharf genug sein sollte, um ohne zusätzliche Kraft durch den Knochen zu dringen. Vermeiden Sie langes, anhaltendes Bohren, da dies Hitze erzeugt. - Prüfen Sie am Ende der Bohrung, ob die Dura Mater intakt und für die Injektion freigelegt bleibt.
- Vorbereitung der Spritzeneinrichtung
- Legen Sie ein Stück Baumwollgaze über den offenen Schnitt und spülen Sie die Spritze mit Kochsalzlösung aus.
- Nehmen Sie nach dem Spülen eine Luftblase von 1–2 μl auf, gefolgt von 1 μl Lösung, die die viralen Vektoren enthält, um unbeabsichtigte Blasenbildung zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Viruslösung während der Injektion unter der Luftblase leicht sichtbar ist.
- Virale Injektion
- Entfernen Sie die Baumwollgaze über der Inzisionsstelle und senken Sie die Spritze mit dem D/V-Arm des stereotaktischen Rahmens ab. Wenn Sie sich der Oberfläche des Schädels nähern, schauen Sie vorsichtig durch das Mikroskop und messen Sie den D/V-Spiegel der Dura mater – er sollte sich unter leichtem Druck leicht ausbeulen.
- Während Sie die Dura mater mit der Spitze der Kapillare berühren, stellen Sie die D/V-Koordinate auf 0,0 ein.
- Senken Sie die Spritze ab und bewegen Sie sich langsam auf die gewünschte Tiefe (D/V = -2,7, bezogen auf Dura mater). Es ist darauf zu achten, dass die Trajektorie frei von Knochenfragmenten ist, so dass keine Biegung der Nadel/Kapillare zu beobachten ist.
HINWEIS: Die angegebenen Koordinaten beziehen sich auf eine Injektion der Reprogrammierungsfaktoren in das Striatum von NG2-Cre-Mäusen. Es können Koordinaten verwendet werden, die anderen Hirnregionen entsprechen. Testen Sie immer zuerst die Koordinaten für die Injektion mit einem Farbstoff (z. B. Trypanblau), einer farbigen Kügelcheninjektion oder einem viralen Reportervektor, bevor Sie Reprogrammierungsfaktoren in das Gehirn eines neuen Mausstamms injizieren. Bei der Injektion von Trypanblau müssen die Tiere unmittelbar nach der Operation getötet und das Gehirn präpariert werden. Frische Gehirne können mit einem Mikrotom geschnitten werden, während sie eingefroren sind, und die Injektionsstelle wird durch Visualisierung der Farbstoffposition im Gehirn bestimmt. Bei der Untersuchung der Koordinaten mit farbigen Kügelchen ist es möglich, eine Woche nach der Injektion die Injektionsstelle an durchbluteten und geschnittenen Gehirnen zu bestimmen. Alternativ kann eine Injektion mit einem viralen Vektor, der ein Reportergen trägt, verwendet werden, und die Injektionsstelle in perfundierten geschnittenen Gehirnen bestimmt werden. - Injizieren Sie 1 μl der Viruslösung mit einer Geschwindigkeit von 0,4 μl/min. Wenn das gesamte Volumen injiziert ist, warten Sie eine Diffusionszeit von 2 Minuten, bevor Sie die Spritze zurückziehen.
- Ziehen Sie die Spritze nach der Diffusion langsam zurück, bis die Spitze der Kapillare vollständig aus dem Gehirn herausragt.
- Legen Sie ein Stück Baumwollgaze über die Wunde und spülen Sie die Spritze mit Kochsalzlösung aus.
- Bewegen Sie den M/L-D/V-Arm des stereotaktischen Rahmens aus dem Arbeitsbereich.
- Wundverschluss und postoperative Eingriffe
- Nähen Sie den Schnitt vorsichtig mit dem Nahtfaden.
HINWEIS: Alle Nahtfäden, die bei injizierten Tieren verwendet werden, sollten in einem Becher/Fläschchen entsorgt werden, das eine antivirale Detergenzienlösung enthält. Die gleiche Lösung wird verwendet, um alle Oberflächen rund um den Operationsbereich zu reinigen, die mit chirurgischen Materialien in Kontakt gekommen sind. Alle chirurgischen Instrumente werden am Ende eines jeden Operationstages gründlich gewaschen und autoklaviert. - Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und setzen Sie es in eine postoperative Station, die einen sauberen, beheizten Käfig, Zugang zu Futter und Wasser umfasst und in der das Tier bleibt, bis es vollständig wach ist. Überwachen Sie das Tier während dieser Zeit genau, bis es wieder zu Bewusstsein kommt.
- Halten Sie operierte Tiere nicht mit nicht operierten Tieren zusammen, bis sich erstere vollständig von der Operation erholt haben.
- Beaufsichtigen Sie die operierten Tiere täglich. Je nachdem, welche Nähte verwendet werden, stellen Sie sicher, dass diese bei Bedarf entfernt werden. Alle Tiere erhielten Bupenorphinum (Temgesic in einer Dosierung von 1 ml/kg) subkutan zur postoperativen Versorgung.
HINWEIS: Wenn Sie an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit derselben Spritze operieren, spülen Sie sie mit Wasser, gefolgt von Ethanol 70 % und erneut mit Wasser. Lassen Sie die Spritze über Nacht mit Wasser gefüllt, damit sich mögliche Rückstände auflösen können.