Elektrophoretische Abgabe von GABA in den epileptischen Fokus einer anästhesierten Maus

Zusammenfassung

Quelle: Slezia, A. et al. Die elektrophoretische Abgabe von γ-Aminobuttersäure (GABA) in den epileptischen Fokus verhindert Anfälle bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die elektrophoretische Verabreichung von Gamma-Aminobuttersäure (GABA) zur Hemmung der Anfallsaktivität bei einer anästhesierten Maus. Es beschreibt die Schritte bei der Sondenimplantation, der Aufzeichnung der neuronalen Aktivität, der Anfallsinduktion und der kontrollierten GABA-Abgabe über eine mikrofluidische Ionenpumpe, um die therapeutische Wirksamkeit zu beurteilen.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden von der örtlichen institutionellen Tierpflegekommission und der tierärztlichen Prüfstelle der JoVE überprüft.

1. Chirurgie/Kraniotomie

1. Fixieren Sie den Kopf einer anästhesierten Maus in einem stereotaktischen Rahmen. Injizieren Sie mit einer 30-G-Nadel das lokale Analgetikum Ropivacain (5 μL, 7,5 mg/ml, siehe Materialtabelle) subkutan an der geplanten Inzisionsstelle. Warten Sie 5 Minuten, bis die Wirkung eintritt.
2. Machen Sie mit einem Skalpell einen geraden Schnitt in der Haut über dem Schädel. Ziehen Sie die Haut mit einer feinen Pinzette vorsichtig zu den Seiten und klemmen Sie sie mit Bulldoggen-Serrefine-Klammern zur Seite, um den Schädel für weitere Arbeiten freizulegen.
3. Reinige den Schädel von den Faszien mit einem Skalpell oder einem ähnlichen Werkzeug. Bei oberflächlichen Blutungen entfernen Sie das Blut mit Wattestäbchen oder kleinen Stücken Papiertuch.
4. Nehmen Sie eine mit Poly(3,4-ethylendioxythiophen) Polystyrolsulfonat (PEDOT:PSS) beschichtete Erdungsschraube (Größe: #00, Durchmesser: 0,047 Zoll, Länge: 1/8 Zoll, siehe Materialtabelle) mit einem Lötdraht und verbinden Sie sie mit einem Stecker mit dem Kopftisch des Verstärkers.
5. Befeuchten Sie den Schädel an der gewünschten Lochstelle und bohren Sie mit einem feinen, runden Bohrer (mit 0,4 mm Durchmesser) ein Loch mit hoher Geschwindigkeit auf den Schädel oberhalb des Kleinhirns, bis die Dura sichtbar ist. Stecken Sie die Schraube in das Loch und schrauben Sie sie mit einem Präzisionsschraubendreher ein, bis sie die Spitze des Kleinhirns erreicht.
   HINWEIS: Die Kopfschraube wurde mit einer PEDOT:PSS-Lösung getaucht, die 1 Gew.-% 3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilan (GOPS) enthält, und anschließend 90 Minuten lang bei 140 °C gebacken. PEDOT:PSS ist ein konjugiertes Polymer mit einer volumetrischen Kapazität, das bekanntermaßen biokompatibel ist. GOPS ist ein Vernetzer, der mit PEDOT:PSS gemischt wird, um die Stabilität in wässrigen Medien zu erhöhen (Abbildung 1).
6. Messen Sie mit Hilfe des stereotaktischen Rahmens die stereotaktischen Koordinaten für die gewünschte Hirnregion. Zum Beispiel ist die interessierende Region der Hippocampus, anteroposterior (AP) -1,8 mm und mediolateral (ML) 1,8 mm vom Bregma-Punkt, basierend auf dem Gehirnatlas für Mäuse.
   HINWEIS: Dies sind Koordinaten für die rechte Hemisphäre (Abbildung 1).
7. Dünnen Sie einen Bereich des Schädels mit einem Durchmesser von etwa 1 bis 2 mm über der Zielregion mit einem zuverlässigen Zahnbohrer (siehe Materialtabelle) aus, der mit hoher Geschwindigkeit eingestellt wird, bis eine dünne, gut polierte, transparente Knochenmembran übrig bleibt.
8. Wenn die Dicke der Knochenmembran dünn genug ist (<200 μm), bohren Sie mit einer dünnen Pinzette ein kleines Loch und entfernen Sie vorsichtig die dünne Schicht des Knochens. Verwenden Sie eine speziell angefertigte Nadel mit Hakenspitze, um die Dura zu entfernen. Minimieren Sie die Größe der Kraniotomie und der Durotomie, um die Entwicklung von Ödemen zu verhindern und die Herz- und/oder Atempulsationen des Gehirns zu minimieren.
   HINWEIS: Die Kraniotomie muss mit einem Tröpfchen Kochsalzlösung gefüllt werden, um ein Austrocknen zu verhindern, und dann während des Experiments regelmäßig nachgefüllt werden (Abbildung 1).

2. Einsetzen der Mehrkanal-Siliziumsonde

1. Verwenden Sie stereotaktische Arme in einem leichten AP-Winkel (20°) für die Siliziumsonde, um ausreichend Platz für die Positionierung der beiden anderen Implantate zu lassen und die Aufnahme- und Injektionsstellen der Elektrode, der Ionenpumpe und der Mikropipette so nah wie möglich zu haben.
   HINWEIS: Elektroden, Spritzen und Ionenpumpen wurden mit einem Tropfen DiI-Färbelösung (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat [DiI]) bedeckt, um die Implantationsspuren (0,5 mg/ml DiI in Dimethylsulfoxid) nachträglich
sichtbar zu machen.
2. Platzieren Sie die Silikonsonde auf dem stereotaktischen Arm, der an einer Magnethalterung befestigt ist, und platzieren Sie sie neben dem stereotaktischen Rahmen. Stellen Sie den AP-Winkel (20°) ein und verbinden Sie dann die Sonde mit dem Kopftisch und mit der Masseschraube.
3. Senken Sie die Silikonsonde mit Hilfe des mikrometergenauen stereotaktischen Arms oder eines motorisierten Mikromanipulators langsam in den Hippocampus ab, um seitliche Bewegungen zu vermeiden (Abbildung 1 und Abbildung 2).
   1. Starten Sie die Aufnahmesoftware und zeichnen Sie mit dem Kopftisch, dem angeschlossenen Verstärker und einem Computer elektrische neuronale Signale auf, während Sie die Mehrkanal-Siliziumsonde von der Spitze des Kortex bewegen, bis die angestrebte dorsoventrale (DV) Position erreicht ist (-1.800 μm von der kortikalen Oberfläche entfernt). Zeichnen Sie das lokale Feldpotentialsignal (LFP) während der Eindringung auf und beobachten Sie es auf dem Computerbildschirm.
      HINWEIS: Steuern Sie das Absinken der Sonde so, dass sie sich während der Aufzeichnung langsam und kontinuierlich bewegt, um eine bessere visuelle Kontrolle über die Eindringung und das Erreichen der Zielzone zu haben.
   2. Verwenden Sie die Rippelaktivität in der pyramidalen Schicht der Hippocampus-Formation im aufgezeichneten LFP als Marker für die Zielzone.
      HINWEIS: Die Rippelaktivität ist auf einem oder zwei benachbarten Kanälen der Mehrkanal-Siliziumsonde (Si) mit einem Abstand von 100 μm zwischen den Aufnahmestellen sichtbar (Abbildung 3).
   3. Erfassen Sie LFP-Signale aus den Schichten des Kortex und des Hippocampus gleichzeitig über die Software des Mehrkanalverstärkers (siehe Materialtabelle) mit Hilfe der Mehrkanal-Si-Sonden (Abbildung 3).

3. Einführung der mikrofluidischen Ionenpumpe (μFIP)

1. Verbinden Sie die Schläuche (siehe Materialtabelle) mit dem Einlass des μFIP und füllen Sie die Sonde mit 0,05 M Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-Lösung. Entfernen Sie die Schläuche und verschließen Sie den Einlass mit einer Paraffinfolienumwicklung. Schließen Sie die elektrischen Leitungen an die Messgeräte der Quelle an.
2. Einführen des μFIP mit Hilfe des stereotaktischen Arms in einem mediolateralen (MP) Winkel (20°). Die Si-Sonde bleibt während des gesamten Prozesses eingeführt.
   HINWEIS: μFIP ist sehr flexibel und kann von der Unterstützung eines kleinen und sauberen Pinsels profitieren, um es gerade zu halten, bis es die Gehirnoberfläche erreicht. Nach diesem Schritt kann μFIP mit axialen Bewegungen sanft abgesenkt werden.
3. Senken Sie den μFIP langsam mit axialen Bewegungen ab und lassen Sie ihn während der Trajektorie niemals biegen, bis er die dorsoventrale (DV) Koordinate erreicht (-1.200 μm von der kortikalen Oberfläche).
   HINWEIS: Versuchen Sie, die beiden Geräte (μFIP und Silikonsonde) so nah wie möglich beieinander zu platzieren, wobei der Abstand des Auslasses von der μFIP-Spitze von 300 μm zu berücksichtigen ist.
   VORSICHT: Vermeiden Sie mechanische Probleme zwischen den Geräten und ihren Anschlüssen während des Einsteckens (Abbildung 1B und Abbildung 2B).

4. Vorbereitung der Geräte für die Anfallsinduktion

1. Wechseln Sie die Metallnadel der Spritze (10 μl) (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie das nadelhaltende Metallteil, setzen Sie die Mikropipette ein und fixieren Sie sie (Außendurchmesser [AD]: 1,2 mm, Innendurchmesser [ID]: 0,75 mm, Spitzendurchmesser: 20–50 μm mit ± 0,5 cm Verjüngung des Schaftes) und setzen Sie dann das Nadelhalteelement wieder ein.
2. Positionieren Sie die Spritze und die beigefügte Borosilikat-Mikropipette in einem Lateromedial (LM)-Winkel von 20° für die Injektion von 4-Aminopyridin (4AP) (50 mM in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit [ACSF]).
   ACHTUNG: Verwenden Sie nicht die Metallnadel der Spritze oder eine Mikropipette mit einer Spitze größer als 50 μm.
3. Ziehen Sie 500 nL–1 μL 50 mM 4AP mit Hilfe einer automatisierten Mikroinjektionspumpe.

5. Einführen der Glaspipette, die für die 4AP-Injektion an einer Spritze befestigt ist

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1. Senken Sie die an der Spritze befestigte Glasmikropipette in die angestrebte DV-Position (-1.500 μm) ab und injizieren Sie dann 250 nL der 4AP-Lösung (Abbildung 1 und Abbildung 2). Starten Sie die Aufnahme mit der Aufnahmesoftware. Beobachten Sie den Bildschirm und warten Sie, bis der erste interiktale Spike erscheint.
2. Beginnen Sie die GABA-Verabreichung durch μFIP sofort mit dem Auftreten des ersten interiktalen Spikes. Geben Sie GABA ab, indem Sie 100 s lang 1 V zwischen Quelle und Ziel anlegen, gefolgt von 1 s aus für 30 Zyklen. Mit Hilfe der Aufnahmesoftware mindestens 2 h.
   HINWEIS: Die Gesamtmasse des abgegebenen GABA beträgt etwa 1 nmol (Abbildung 4).
3. Entfernen Sie am Ende des Versuchs vorsichtig die eingesetzten Sonden und die Erdungsschraube und entfernen Sie das Tier aus der stereotaktischen Ausrüstung. Die Tiere wurden mit einer Überdosis des Medikaments (i.p.100mg/kg Pentobarbital) euthanasiert. Der Tod wurde durch Atem- und Kreislaufstörungen bestätigt.

Ergebnisse

Abbildung 1: Cranio-Dulotomie und Lokalisation der Implantate im Gehirn der Maus. (A) Schematische Darstellung der Operation, der Kraniotomie und des Ziels der Implantate im Gehirn der Maus. (B) Stereotaxische...

Materialien