Stereotaktische Virusinjektion zur gezielten neuronalen Geneditierung im Gehirn von Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Fricano-Kugler, C. J., et al. Design, Verpackung und Verabreichung von CRISPR-Retro- und Lentiviren mit hohem Titer durch stereotaktische Injektion. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die stereotaktische Virusinjektion zur präzisen neuronalen Geneditierung im Gehirn von Mäusen. Das Protokoll gewährleistet eine genaue Virusabgabe an den Gyrus dentatus und ermöglicht die Fluoreszenzmarkierung und den CRISPR-vermittelten Gen-Knockout, um neuronale Schaltkreise, Genfunktionen und Krankheitsmechanismen in vivo zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Stereotaktische Injektion

1. Vergewissern Sie sich, dass die Belüftung des Operationssaals geöffnet ist, um einen ordnungsgemäßen Luftstrom zu gewährleisten. Bereiten Sie die Maus auf die Operation vor, indem Sie sie in einer Induktionskammer mit 4% Isofluran anästhesieren. Rasieren Sie nach der Anästhesie den Kopf, um die Injektionsstelle vorzubereiten.
   1. Platziere die Maus in das stereotaktische Instrument, indem du die Zunge mit einer Pinzette nach unten und zur Seite bewegst. Führen Sie die Beißstange in den Mund ein, bis die Zähne in den Schlitz fallen, und befestigen Sie dann die Ohrstangen. Stellen Sie sicher, dass sich das Gehäuse der Maus auf dem Heizkissen befindet und sich die Nase im Nasenkonus befindet. Leiten Sie 4% Isofluran in den Nasenkonus. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie den Fuß mit einer Pinzette einklemmen und sicherstellen, dass kein Schreckreflex auftritt.
   2. Tragen Sie künstliche Tränen auf, um die Augen zu befeuchten. Beenden Sie die Vorbereitung der Injektionsstelle, indem Sie den rasierten Kopf abwechselnd mit Povidon-Jod und Lidocain abtupfen.
2. Schneiden Sie mit einem Skalpell einen kleinen Schnitt in der Mitte der Kopfhaut. Trocknen Sie den Schädel mit einem Tupfer und bei Bedarf mit Wasserstoffperoxid, um Bregma sichtbar zu machen.
   1. Lokalisieren Sie mit einem Präparierfernrohr das Bregma auf dem Schädel und platzieren Sie die Bohrspitze auf dem Bregma. Setzen Sie die digitalen stereotaktischen Koordinaten auf den X-, Y- und Z-Ebenen auf Null (oder zeichnen Sie sie auf).
   2. Um sicherzustellen, dass der Kopf auf der rostralen bis kaudalen y-Achse waagerecht ist, platzieren Sie den Bohrer auf Lambda und richten Sie den Kopf so aus, dass die z-Koordinate sowohl bei Bregma als auch bei Lambda ungefähr gleich ist.
   3. Um sicherzustellen, dass der Kopf auf der x-Achse waagerecht steht, platzieren Sie den Bohrer bei y = 1/2 Lambda. Stellen Sie sicher, dass die Z-Koordinate auf jeder Seite (x = +/-1 mm) der sagittalen Naht gleich 1 mm ist. Passen Sie den Schädel an, wenn es einen Unterschied in der Z-Koordinate bei 1 mm links und rechts von Lambda gibt.
3. Platzieren Sie den Bohrer über den gewünschten Koordinaten. Für den Gyrus dentatus verwenden Sie die Koordinaten y = -1,9 aus dem Bregma und x = +/- 1,1. Senken Sie vor dem Bohren den Isofluran auf 2% und bohren Sie dann langsam und vorsichtig durch den Schädel.
   1. Nachdem du alle Löcher gebohrt hast, befestige die gefüllte Spritze auf dem stereotaktischen Instrument. Zentrieren Sie die Spritze visuell über dem Loch und stellen Sie die z-Koordinate am Schädel auf Null.
   2. Senken Sie die Spritze langsam auf die tiefste Z-Tiefe ab. Für den Gyrus dentatus betragen die z-Tiefen -2,5, -2,4 und -2,3. Beginnen Sie die Injektion mit einer Geschwindigkeit von 0,25 μl/min unter Verwendung eines stereotaktischen Injektors.
      1. Nachdem die Injektion in der niedrigsten Z-Tiefe abgeschlossen ist, warten Sie 1 Minute, erhöhen Sie dann auf die nächste Koordinate und beginnen Sie die Injektion erneut. Setzen Sie dieses Muster fort, bis alle Z-Injektionskoordinaten injiziert sind. Warten Sie 2 Minuten, bevor Sie die Spritze nach der letzten Injektion entfernen.
         HINWEIS: Bei der Injektion von bis zu 2 μl Virus pro Hemisphäre in das Gehirn der Maus wurden keine nachteiligen Auswirkungen auf das Gewebe festgestellt.
   3. Wiederholen Sie die Injektion für andere Bohrungen.
4. Entfernen Sie nach der Injektion die Maus aus dem stereotaktischen Instrument und vernähen Sie die Kopfhaut mit 6-0 Seidennähten. Tragen Sie Lidocain und eine antibakterielle Creme auf die Wunde auf.
   1. Injizieren Sie 0,8-1,0 ml Kochsalzlösung + Ketoprofen (3-5 mg/kg) über den intraperitonealen (I.P.) Weg, um Schmerzen zu behandeln. Setzen Sie dann die Maus in die beheizte Auffangkammer ein. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Geben Sie das Tier nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Vet-Spritze für Tierärzte verwenden nur T.B. Spritze 1cc Luer-Slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isofluran
Skalpellklingen aus Edelstahl, #10, 100 Stück	Med-Vet International	JOR580S
Künstliche Tränensalbe	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
Normale Kochsalzlösung	Med-Vet International	DYND500MLSH
Applikatoren mit Wattespitze	Med-Vet International	CTA6
Dreifache antibiotische Salbe	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Nadeln Soft Pack 25g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 Seidennähte	Med-Vet International	MV-711

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