Visualisierung neuronaler und vaskulärer Netzwerke in einem Hühnerembryo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Delalande, J., et.al. Doppelte Markierung von Neuralleistenzellen und Blutgefäßen in Hühnerembryonen mittels^{Küken-GFP-Neuralrohrtransplantation} und Carbocyanin-Farbstoff-DiI-Injektion. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt die Transplantation eines GFP-markierten Spender-Neuralrohrs von einem transgenen Hühnerembryo in einen Empfängerembryo auf der Ebene der Somiten eins bis sieben, gefolgt von der Gefäßmarkierung mit einem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff. Der kombinierte Ansatz ermöglicht die direkte Visualisierung des Embryos unter einem Stereofluoreszenzmikroskop und ermöglicht so die Untersuchung der Integration von neuralen Transplantaten und der Entwicklung des Gefäßnetzwerks bei Ovo.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Transplantieren Sie das Gewebe

Übertragen Sie das präparierte Neuralrohr vorsichtig mit einer Mikropipette aus dem Uhrglas auf den Wirtsembryo. Positionieren Sie das Neuralrohr in der richtigen anterior-posterioren Ausrichtung und schieben Sie das Explantat mit dem Mikroskalpell vorsichtig neben die exzidierte Region des Wirtskükens. Lassen Sie ein kleines Fragment des Ektoderms an der dorsalen Oberfläche befestigt oder schneiden Sie eine kleine Kerbe in die dorsale Oberfläche, um die Ausrichtung des Neuralrohrs zu identifizieren.
1. Falls nötig, verwenden Sie das Mikroskalpell, um das Explantat auf die exakte Größe der herausgeschnittenen Region zu trimmen.
Führen Sie das Neuralrohr vorsichtig in den abgetragenen Bereich und positionieren Sie es so, dass die dorsale Seite richtig ausgerichtet ist. Verwenden Sie eine Mikropipette aus Glas, die an einem Mundrohr befestigt ist, um PBS und/oder die Flüssigkeit, die das Transplantat umgibt, zu entfernen. Dies hilft dem Spender- und Wirtsgewebe, zu verkleben und das Transplantat zu etablieren.
Versiegeln Sie das gesamte Fenster mit 24 mm breitem, durchsichtigem Klebeband, um Austrocknung und Kontamination zu verhindern.
Beschriften Sie den chimären Embryo, indem Sie ihn mit einem Bleistift auf der Eierschale markieren, und notieren Sie seine Nummer im Laborbuch. Lege das Ei zur weiteren Entwicklung in den Brutkasten zurück.

2. DiI in die Blutgefäße des Wirtsembryos injizieren

Nehmen Sie

zum gewünschten Versuchszeitpunkt (hier 3 - 10 Tage später) den chimären Embryo aus dem Inkubator und entfernen Sie das durchsichtige Klebeband mit einer geraden Schere, um Zugang zum Embryo in der Eizelle zu erhalten.
Vergrößern Sie ggf. das Fenster in der Schale mit der Schere. Achten Sie darauf, die chorioallantoische Membran nicht zu beschädigen, wenn sie an der Schale befestigt ist, was zu Blutungen führen und die Markierung der Blutgefäße gefährden würde.
Wählen Sie eine zugängliche Vene im Eigelb und stellen Sie sicher, dass der Blutfluss zum Embryo geleitet wird. Wählen Sie einen Verzweigungspunkt einer der Vitellinvenen (Abbildung 1B, C).
HINWEIS: Bei E6,5 - E7,5 muss die Chorioallantoismembran möglicherweise vorsichtig mit einer Pinzette zur Seite geschoben werden, um Zugang zu den Dottervenen zu erhalten. Nach E8.5 besteht die einzige Möglichkeit darin, in eine der Venen der Chorioallantoismembran zu injizieren, da die Chorioallantoismembran den Embryo zu diesem Zeitpunkt vollständig bedeckt.
Entfernen Sie die Vitellinmembran oberhalb des gewählten Einspritzpunkts mit zwei Dumont #5 Pinzetten, indem Sie in entgegengesetzte Richtungen reißen.
Brechen Sie eine gezogene Glasnadel mit einem Dumont #5 und passen Sie ihren Durchmesser vor dem Laden mit dem CellTracker CM-DiI an die ungefähre Größe der Vene an. Die DiI-Stammlösung bei 40 μg/μl in DMSO herstellen und bei -20 °C lagern. Die Arbeitslösung in 0,3 M Saccharose/PBS in einer Konzentration von 4 μg/μl herstellen.
1. 5 - 10 μl DiI in 0,3 M Saccharose/PBS durch Ansaugen mit einem Mundschlauch in die Nadel aspirieren. Ältere Embryonen können bis zu 25 μl oder mehr benötigen. Ab E8.5 haben Embryonen größere, muskulösere Venen, die möglicherweise mit einem Dumont #5 in Position gehalten werden müssen, bevor sie mit der DiI-geladenen Glasnadel stechen
Führen Sie die Nadel schnell in die Vene ein und blasen Sie gleichmäßig mit dem Mundschlauch, damit der DiI langsam in den Blutfluss einsteigen kann, ohne dass sich ein Gerinnsel bildet. Alternativ können Sie einen Druckinjektor für die DiI-Abgabe verwenden.

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Ergebnisse

Abbildung 1. Intravenöse DiI-Injektion. (A) Empfohlene Instrumente: a) CellTracker CM-DiI Tropfen auf Parafilm, b) gezogene Glasinjektionsnadel, c) Mundschlauch. (B) Schematische Darstellung der intravenösen DiI-Injektion in ein...