Echtzeit-In-vitro-Bildgebung der axonalen Verzweigung in kortikalen Neuronen der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Winkle, C. C., et al. Unter Verwendung kombinierter Methoden zur Definition der Rolle der Plasmamembranabgabe während der Axonverzweigung und der neuronalen Morphogenese. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt eine Live-Imaging-Technik mit Hilfe der Differential-Interferenzkontrast-Mikroskopie (DIC), um die axonale Verzweigung in kortikalen Neuronen in Echtzeit zu beobachten. Zeitraffervideos zeigen die Auswirkungen der Behandlung mit Netrin-1, einem Signalmolekül, das lokalisierte Exozytose und Umlagerungen des Zytoskeletts in Axonen induziert. Diese Prozesse initiieren Membranvorsprünge, die sich zu reifen axonalen Ästen entwickeln und Einblicke in die neuronale Entwicklung geben.

Protokoll

1. Zeitraffermikroskopie des differentiellen Interferenzkontrasts (DIC) der Axonverzweigung

Hinweis: Während dieses Protokoll DIC verwendet, können andere Methoden der Durchlichtmikroskopie für die gleichen Zwecke verwendet werden (z. B. Phasenkontrast).

1. Stellen Sie nach 2 Tagen in vitro (DIV) eine Bildgebungsschale mit Glasboden mit untransfizierten Neuronen in eine vorgewärmte Klimakammer, um eine feuchte Umgebung mit 5 % CO2 und 37 °C zu erhalten. Verwenden Sie ein Mikroskop, das mit einem 60-fachen Plan-Apochromaten, einer DIC-Objektivlinse mit numerischer Apertur (NA) und einem Kondensor mit hoher NA-Apertur ausgestattet ist, um beste Bildqualität und Auflösung zu erzielen.
2. Stellen Sie die Fokusebene so ein, dass Neuronen mithilfe der Durchlichtbeleuchtung durch das Okular gefunden werden.
3. Mit der Mehrbereichserfassungsfunktion der Bildgebungssoftware können Sie die XYZ-Positionen von mindestens 6 Zellen suchen und speichern. Positionieren Sie den Tisch so, dass die interessierenden Neuronen in das Sichtfeld passen, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
   1. Stimulieren Sie mit 250 ng/ml Netrin-1 und drücken Sie 'Multi-Area-Erfassung starten'. Erfassen Sie Bilder sequenziell alle 20 Sekunden für 24 Stunden an jeder Position, unterbrechen Sie die Aufnahme und fokussieren Sie bei Bedarf neu.
4. Überprüfen Sie Bilder in der Imaging-Software mit Apps>Review Multi Dimensional Data>open Dateinamen. Identifizieren Sie stabile Axonäste (20 μm lang), die sich während der Bildgebungssitzung bilden. Verwenden Sie das Strichzeichnungswerkzeug, um einen stabilen Axonast von der Basis des Axons bis zur Spitze zu messen, um sicherzustellen, dass die Längenqualifikation von 20 μm erfüllt ist.
   1. Notiere in einer Tabelle die Frame-Nummer nach der Netrin-Stimulation, wenn Membranvorsprünge in Bereichen entstehen, in denen sich später Äste bilden, sowie die Frame-Nummer nach der Netrin-Stimulation, wenn entstehende Äste eine Länge von 20 μm erreichen.
   2. Multiplizieren Sie die Anzahl der Frames zwischen Protrusion und Astbildung mit 20 Sekunden, um die Entstehungszeit pro Ast zu berechnen.

Materialien