In vivo Zwei-Photonen-Bildgebung der Mikrogliadynamik im Hippocampus der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)

Das Video zeigt den Aufbau und den Bildgebungsprozess für die in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie der Mikrogliadynamik im hippokampalen CA1 (Cornu ammonis 1) und im Gyrus dentatus, um eine optimale optische Ausrichtung und Beurteilung der strukturellen Integrität zu gewährleisten.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. In vivo, chronische Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia mit CX3CR1-GFP-Mäusen

1. Nach Einleitung der Anästhesie waschen Sie das Innere des Metallröhrchens mit steriler Kochsalzlösung, um Ablagerungen zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die weiße Alveus des Hippocampus durch das Glas sichtbar ist (Abbildung 1A) und dass es keine Komplikationen, wie z. B. postoperative Blutungen, gibt.
2. Setzen Sie die Maus in den folgenden Schritten unter das Zwei-Photonen-Mikroskop:
   1. Setzen Sie die Maus in die Kopfhaltevorrichtung unter die Objektivlinse des Zwei-Photonen-Mikroskops und auf den motorisierten XY-Scantisch. Verwenden Sie ein Heizkissen zur thermischen Unterstützung. Überwachen und passen Sie die Anästhesietiefe an, da diese Qualitätsprüfung bis zu 30 Minuten dauern kann. Anmerkung: Empfohlen wird das Wasserimmersionsobjektiv mit einem Arbeitsabstand (WD) von mehr als 3 mm und einer hohen numerischen Apertur (NA). Ein Korrekturring der Objektivlinse kann die Auflösung verbessern, indem er die Brechungsindex-Fehlanpassung zwischen dem Glas und den Biomaterialien ausgleicht.
   2. Füllen Sie den Raum zwischen dem Glas und der Objektivlinse mit Wasser und achten Sie besonders darauf, Luftblasen zu vermeiden. Erweitern Sie bei Bedarf den Bereich der Metallplatte mit einer Kunststofffolie, die mehr Wasser hält, um die gesamte Frontlinse des Objektivs abzudecken.
   3. Schalten Sie einen gepulsten Femtosekundenlaser mit einer Wellenlänge von 920 nm für die Anregung der im Gehirn exprimierten Fluoreszenzsonden ein und starten Sie die Bildaufnahmesoftware.
   4. Stellen Sie den Fokus mit dem motorisierten Tisch und dem motorisierten Fokussystem auf den CA1 (Cornu Ammonis 1) ein. Positionieren Sie die Zielstruktur unter Führung der vom Hirnparenchym emittierten Fluoreszenz und des vom Rand des Metallrohrs reflektierten Lichts unter kontinuierlicher Beleuchtung durch den gepulsten Laser.
   5. Messen Sie die Tiefen des Hirnparenchyms, das den Glasboden berührt, indem Sie den Fokus mit dem motorisierten Fokussystem einstellen. Vergleichen Sie die Tiefen an verschiedenen horizontalen Positionen, um die Ausrichtung des Glasbodens und der Bildgebungsebene zu beurteilen.
      1. Stellen Sie den Winkel des Mauskopfes ein, indem Sie den Kopfhalter neigen, bis der Glasboden so eingestellt ist, dass er parallel zur Bildebene ist.
   6. Passen Sie den Korrekturkragen des Ziels an, um die höchste Auflösung in der Tiefe der Zielstruktur in CA1 zu erreichen.
3. Überprüfen Sie die Qualität und Intensität der Bilder, die durch Zwei-Photonen-Anregung des Hippocampus erhalten wurden (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Eine Bildverschlechterung weist auf das Vorhandensein von Gewebeschäden im Gehirn hin.
4. Stellen Sie sicher, dass die Mikroglia ihre verzweigte Morphologie bereits wiedererlangt haben (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Die bildgebenden Daten der Mikroglia zeigen, dass die Mikroglia mindestens 3-4 Wochen benötigen, um in ihren basalen Zustand zurückzukehren.
5. Führen Sie eine In-vivo-Bildgebung in beliebigen Schichten des CA1 für den speziellen Zweck des Experiments durch.

Ergebnisse

Abbildung 1: In-vivo-Bildgebung von Mikroglia in CX3CR1-GFP-Mäusen in der chronischen Phase. (A) Das repräsentative Erscheinungsbild des implantierten Fensters am rechten dorsalen CA1 (...

Materialien