Bildgebung von schnellen Kalziumtransienten in Nervenenden von Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Zhilyakov, N. V. et. al., Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert die bildgebende Technik zur Aufzeichnung schneller Kalziumtransienten an Nervenenden mittels konfokaler Mikroskopie. Durch die Stimulation des Nervs und das Erfassen von Fluoreszenzänderungen von kalziumbindenden Farbstoffen visualisiert es den dynamischen Kalziumeinstrom und die Clearance am Nervenende und bietet so genaue Einblicke in die synaptische Aktivität und die neuromuskuläre Signalgebung.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

Die Versuche wurden an isolierten Nerven-Muskel-Präparaten von Levator auris longus (m. LAL) aus der Maus BALB/C (20-23 g, 2-3 Monate alt) durchgeführt.

1. Zubereitung der Ringer- und Feillösungen

1. Bereiten Sie die Ringer-Lösung für den Säugetiermuskel vor, indem Sie die folgenden Zutaten mischen: Natriumchlorid, NaCl (137 mM), Kaliumchlorid, KCl (5 mM), Calciumchlorid, CaCl₂ (2 mM), MgCl₂ (1 mM), NaH₂PO₄ (1 mM), NaHCO₃ (11,9 mM) und Glukose (11 mM). Mit 95 % Sauerstoff (_{O 2}) und 5 % Kohlendioxid (CO₂) durch die Lösung sprudeln lassen und den pH-Wert durch Zugabe von Salzsäure/Natriumhydroxid (HCl/NaOH) auf 7,2-7,4 einstellen.
2. Bereiten Sie die Farbladelösung vor.
   1. Bereite (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) (10 mM) Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 7,2-7,4 vor. 500 μg handelsüblicher Farbstoff kommen in einem 500 μL Fläschchen. Lösen Sie den Farbstoff in 14 μl der HEPES-Lösung, um eine Farbstoffkonzentration von 30 mM zu erhalten. Gut schütteln und zentrifugieren, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
   2. Verdünnen Sie die Lösung des Ca2⁺-Indikators mit HEPES-Lösung bis zu einer Konzentration von 1 mM. Bewahren Sie es im Gefrierschrank (-20 °C) auf und vermeiden Sie Lichteinwirkung.

2. Verfahren zum Laden von Farbstoffen

HINWEIS: Das Verfahren zum Laden von Farbstoffen wird gemäß dem Protokoll für das Laden durch den Nervenstumpf durchgeführt, das an die zuvor veröffentlichten Protokolle angepasst ist.

1. Präparieren Sie den LAL-Muskel gemäß dem Präparierungsverfahren für dieses Präparat, wie es in den zuvor veröffentlichten Protokollen beschrieben ist.
   1. Fixieren Sie das Gewebe leicht gedehnt (nicht mehr als 30 % von der ursprünglichen Länge) mit feinen Edelstahlstiften in der elastomerbeschichteten Petrischale und fügen Sie Ringer-Lösung hinzu, bis der Muskel vollständig bedeckt ist.
      HINWEIS: Die Petrischale wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Elastomer vorgefüllt (siehe Materialtabelle).
2. Bereiten Sie die Füllpipette vor
   1. Bereiten Sie mit einem Mikropipettenabzieher (siehe Materialtabelle) eine Mikropipette mit einer feinen Spitze vor, die so scharf wie möglich für die intrazellulären Aufzeichnungen ist. Verwenden Sie Kapillaren ohne innere Filamente (1,5 mm Außendurchmesser und 0,86 oder 1,10 mm Innendurchmesser).
   2. Brechen Sie die Spitze der Mikropipette ab, nachdem Sie den Kegel mit einem Schleifmittel eingeritzt haben, und lassen Sie die Spitze bis zu einem Durchmesser von etwa 100 μm offen. Politur der Spitze nach unten, um den Innendurchmesser von >80 μm auf 12-13 μm zu begrenzen. Befestigen Sie einen Silikonschlauch an einer Seite der Füllpipette und eine Spritze (ohne Nadel) an der anderen Seite.
3. Finden Sie unter einem Stereomikroskop die Stelle, an der sich der Nervenstamm in separate Nervenäste verwandelt. Legen Sie die Füllpipette mit dem montierten Röhrchen und der Spritze mit Wachs auf die Petrischale. Bewegen Sie die Pipettenspitze, bis sie über dem Nerv steht.
4. Schneiden Sie den Nerv mit einer feinen Schere in der Nähe der Muskelfaser ab, so dass ein kleines Stück des Nervenstumpfes etwa 1 mm lang bleibt. Saugen Sie den Nervenstumpf zusammen mit etwas Ringer-Lösung, ohne ihn einzuklemmen, vorsichtig in die Spitze der Füllpipette ein. Entfernen Sie den Silikonschlauch aus der Einfüllpipette.
5. Ziehen Sie eine gewisse Menge der Farbstoffladelösung (~0,3 μl) mit einer Spritze mit einem langen Filament auf. Dieses Volumen entspricht ca. 3 cm des Filaments.
   HINWEIS: Zunächst ist es notwendig, aus einer Pipettenspitze mit einem Volumen von 10 μL einen Filament herzustellen, indem man mit einer Alkohollampe oder einem Gasbrenner am Feuer zieht.
6. Führen Sie die Filamentspitze mit der Ladelösung vorsichtig in die Füllpipette ein. Geben Sie die Mischung direkt auf den Nervenstumpf. Inkubieren Sie das Präparat bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min.
7. Danach das Präparat mit frischer Ringer-Lösung abspülen und bei 25 °C bis zu 2 h in einem Becherglas mit 50 mL (oder mehr) Ringer-Lösung inkubieren (das Präparat muss mit der Lösung bedeckt sein). Während dieser Zeit gelangt der Farbstoff in die Synapsen.

3. Videoaufnahme mit konfokaler Mikroskopie

HINWEIS: Die Registrierung von Kalziumtransienten erfolgt mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSCM) (siehe Materialtabelle). Um schnelle Kalziumtransienten zu registrieren, wurde ein originelles Protokoll verwendet, das die Aufzeichnung von Signalen mit einer ausreichenden räumlichen und zeitlichen Auflösung ermöglichte. Das Mikroskop war mit einem 20-fach Wasserimmersionsobjektiv (1,00 numerische Apertur (NA)) ausgestattet. Die 488-nm-Laserlinie wurde auf eine Intensität von 10 % abgeschwächt und die Emissionsfluoreszenz von 503 bis 558 nm erfasst.

1. Montieren Sie das Präparat in die mit Silikonelastomer beschichtete Versuchskammer und fixieren Sie es leicht gestreckt mit einem Satz Mikronadeln aus Stahl. Spülen Sie das Präparat ausgiebig mit der Ringer-Lösung aus.
   HINWEIS: Es wurde eine einfache, maßgefertigte Perfusionsversuchskammer aus organischem Glas verwendet, deren Boden mit einem Elastomer bedeckt ist (hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers; siehe Materialtabelle). Die Kammer verfügt über ein Lösungszufuhrrohr. Die Lösung wird über eine Spritzennadel abgepumpt, die auf einer Magnethalterung montiert ist (siehe Materialtabelle). Als Versuchskammer könnte eine Petrischale verwendet werden (wie die, die für die Inkubation des Präparats verwendet wird), jedoch mit angeschlossenen Versorgungs- und Saugrohren.
2. Installieren Sie eine Saugelektrode, die zur Stimulation des Nervs verwendet wird.
   HINWEIS: Platzieren Sie die Elektrode und befestigen Sie sie, indem Sie sie neben das Bad wachsen. Bewegen Sie die Spitze nahe an den Nervenstumpf und saugen Sie sie in die Elektrode ab.
3. Montieren Sie die Präparationskammer auf den Mikroskoptisch und setzen Sie die Einlass- und Auslassarmaturen in die Kammer ein.
4. Um das Präparat zu perfundieren, verwenden Sie ein einfaches, durch Schwerkraft angetriebenes System. Schalten Sie die Perfusionssaugpumpe ein, um die überschüssige Lösung zu entfernen.
5. Stecken Sie die stimulierende Saugelektrode in einen elektrischen Stimulator und stellen Sie sicher, dass nach der Stimulation Muskelkontraktionen auftreten. Siehe Abschnitte 3.9-3.12 für Stimulationsbedingungen und Aufnahmen.
6. Füllen Sie das Perfusionssystem mit der Ringer-Lösung mit d-Tubocurarin (10 μM).
   HINWEIS: Diese Lösung hilft, Muskelkontraktionen zu verhindern. D-Tubocurarin oder Alpha-Bungarotoxin-spezifische Blocker von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren auf der postsynaptischen Membran würden Muskelkontraktionen ganz oder teilweise blockieren50. Zur Vorbeugung von Muskelkontraktionen könnten auch spezifische Blocker postsynaptischer Natriumkanäle wie μ-Conotoxin GIIIB verwendet werden51.
7. Schalten Sie die Perfusionssaugpumpe ein und beginnen Sie mit der Perfusion des Präparats mit der Ringer-Lösung, die d-Tubocurarin enthält.
8. Stellen Sie die Bildgebungsparameter in der LSCM-Software wie folgt ein.
   1. In der LSCM-Software (LAS AF; siehe Materialtabelle) wählen Sie Elektrophysiologie.
      HINWEIS: Wenn in diesem Modus ein Bild zum richtigen Zeitpunkt aufgenommen wird, wird mit Hilfe der Auslösebox ein Synchronisationsimpuls an den Stimulator gesendet. Dies löst die Generierung von Aktionspotenzial in der Zubereitung aus (Abbildung 1; Stimulatoreinheit).
   2. Wählen Sie den Aufnahmemodus aus. Um den Stimulator mit dem Mikroskop-Synchronisationsimpuls auszulösen, wählen Sie in den Einstellungen des Job-Menüs die Trigger-Einstellungen aus. Legen Sie das Feld "Trigger Out On Frame" auf den Kanal out1 fest.
   3. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Scan-Modus: XYT, Scanfrequenz: 1400 Hz, Zoomfaktor: 6,1, Lochblende: vollständig geöffnet. Stellen Sie sicher, dass der sequentielle Transpassing Bidirektionale X-Modus aktiviert ist.
   4. Legen Sie die Mindestzeit für die Bildung eines Frames auf 52 ms und die für die Erfassung von Frames in einem Rohvideo auf 20 Frames fest.
      HINWEIS: Diese Einstellungen ermöglichen die Aufnahme von Bildern mit einer Auflösung von 128 x 128 Pixeln, während alle 52 ms ein einzelnes Bild aufgenommen wird.
   5. Die Anregungswellenlänge des Argon-Lasers wird auf 488 nm mit 8 % der Ausgangsleistung eingestellt.

Drücken Sie die Live-Modus-Taste, um in den Live-Modus zu wechseln, der Ihnen hilft, eine Vorschau der mit dem Farbstoff geladenen Nervenenden zu erhalten.

9. Stimulationseinheit
   HINWEIS: Dieses Gerät ermöglicht die Einstellung von zeitlichen Parametern der Stimulation über die MATLAB-Software.
   1. Erstellen Sie eine neue Datei, fügen Sie den Code aus dem oben genannten Artikel in das MatLab-Codefenster ein und speichern Sie die Datei. Klicken Sie auf Run, woraufhin ein Fenster mit Stimulationsparametern erscheint. Stellen Sie die Verzögerungszeit und die Dauer des Stimulus ein.
      HINWEIS: Die Verzögerung bestimmt die zeitliche Auflösung des rekonstituierten Fluoreszenzsignals. Der elektrische Impuls mit einer Dauer von 0,2 ms wird verzögert und dann an die Isolationseinheit gesendet. Letzteres bildet die Amplitude und Polarität des Stimulationsimpulses und isoliert das biologische Objekt elektrisch vom Aufzeichnungsgerät.
   2. Um den Nerv zu stimulieren, wählen Sie die supramaximale Amplitude des Stimulationsimpulses (25%-50% größer als die maximale Stimulationsintensität, die zur Aktivierung aller Nervenfasern erforderlich ist).
      HINWEIS: Das vorgestellte Verfahren basiert auf einem speziellen Algorithmus zur Aufzeichnung einzelner schneller Fluoreszenzsignale unter Verwendung von LSCM mit minimiertem Sweep. Bei jedem Schritt des entwickelten Algorithmus wird das aufgezeichnete Fluoreszenzsignal um ein Zeitintervall verschoben, das kürzer ist als der Mikroskop-Sweep. Der Wert der Zeitverschiebungen bestimmt die zeitliche Auflösung des benötigten Signals. Die Anzahl der Schritte (Verschiebungen) im Algorithmus hängt von der erforderlichen zeitlichen Auflösung und der ursprünglichen zeitlichen Auflösung ab. Bei dieser Registrierungsmethode erfolgt die Stimulation des Präparats mit einer Frequenz von 0,25 Hz.
10. Suchen Sie im Live-Modus nach dem ROI und erhalten Sie den besten Fokus. Führen Sie die Datenerfassungssoftware aus.
11. Verschieben Sie die Verzögerung am Stimulator um 2 ms weniger im Vergleich zum vorherigen Wert und führen Sie die Datenerfassungssoftware aus.
12. Wiederholen Sie Schritt 3.11 26 Mal, um 26 Sequenzen zu erhalten, wobei jede Sequenz um 2 ms gegenüber der vorherigen verschoben ist.

Ergebnisse

Abbildung 1: Das Schema des Versuchsaufbaus. 1. Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (LSCM). 2. Synchronisationsmodul des LSCM (Triggerbox). 3. Stimulator. 4. Isolationseinheit. 5. Die biologische Probe. 6. Saugelektrode zur elektrischen Stimulation des Ne...

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