Osmotische Pump-basierte neurotherapeutische Wirkstoffabgabe in einem demyelinisierten Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Wang, X. et. al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Methode zur Verabreichung von Neurotherapeutika mit einer osmotischen Pumpe in einem demyelinisierten Mausmodell. Die kontrollierte Wirkstofffreisetzung fördert die Remyelinisierung, indem sie myelinproduzierende Zellen im Corpus callosum aktiviert.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Etablierung des Mausmodells der Lysolecithin-induzierten Demyelinisierung

1. : Bereiten Sie 1%ige Lysolecithin-Lösung (auch L-α-Lysophosphatidylcholin genannt) mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor.
2. Sterilisieren Sie Scheren, Pinzetten, gebogene Hämostaten und andere chirurgische Instrumente durch Autoklavensterilisation. Sterilisieren Sie den Operationsbereich und legen Sie sterile Tücher aus. Alle Materialien und Reagenzien, die für die Operation verwendet werden, sollten aseptisch hergestellt werden. Es ist wichtig, dass der Operationsbereich während des gesamten Eingriffs steril bleibt.
3. Anästhesieren Sie eine C57BL6-Maus am postnatalen Tag 56 (P56) wie folgt.
   1. Platzieren Sie die Maus in der Isoflurankammer des Anästhesiegeräts für Kleintiere. Passen Sie den_O2-Fluss auf 300-500 ml/min und den Isofluran auf 3%-4% an. Wenn die Maus nach ausreichender Anästhesie mit einem langsamen und stabilen Atem unbeweglich wird, übertragen Sie die Maus mit einem Heizkissen in das stereotaktische Gerät.
   2. Schalten Sie den Gasausgang aus der Kammer auf die Anästhesiemaske um und stellen Sie den Isofluran auf 1 % bis 1,5 % ein, um die Maus im Anästhesiezustand zu halten. Warten Sie, bis die Maus vollständig betäubt ist, und injizieren Sie dann intraperitoneal Ketoprofen (3–5 mg/kg), um die Schmerzen zu lindern. Kneifen Sie vor der Operation die Zehen der Maus ein und überprüfen Sie ihre Reaktion, um eine erfolgreiche Anästhesie zu bestätigen.
   3. Wenn die Maus betäubt ist, kann sie ihre Körpertemperatur nicht regulieren. Überwachen und regulieren Sie daher die Körpertemperatur der Maus während der Operation. Bedecken Sie die Oberfläche der Augäpfel der Maus mit Erythromycin-Augensalbe, um die Augäpfel während der Narkose feucht zu halten.
4. Befestigen Sie den Mauskopf in der stereotaktischen Apparatur mit Zahnstange und Ohrbügeln. (Abbildung 1A).
5. Verwende einen Rasierer, um Haare von der Oberseite des Kopfes zu entfernen. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei Zyklen Betadin und 75% Ethanol. Aus ethischen Gründen den Tierkörper mit Ausnahme der Operationsstelle abdecken. Machen Sie mit einem Skalpell einen 1 cm langen mittleren sagittalen Schnitt in der Haut von der Basis des Halses bis zwischen den Augen, um den Schädel freizulegen (Abbildung 1B).
6. Wischen Sie die Oberfläche des Schädels vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen ab, das 30 % Wasserstoffperoxid enthält, um die Schädelnähte sichtbar zu machen (Abbildung 1C). Passen Sie die Höhe der Zahnstange und der Ohrstangen an, um den Lambda-Punkt und den Bregma-Punkt auf der gleichen Höhe zu platzieren (d. h. mit den gleichen Koordinaten der Z-Achse, wenn die Nadelspitze die Punkte berührt), so dass die sagittale Naht horizontal ist.
7. Platzieren Sie die Spitze der Mikroliter-Spritzennadel (10 μl, 33 G) vorsichtig am Bregmapunkt und setzen Sie die x-, y- und z-Koordinaten auf 0 zurück (Abbildung 1D). Bewegen Sie die Spritze an die Injektionsstelle (x: 1,04; y: 1,0, d. h. 1,04 mm lateral zur Mittellinie und 1,0 mm posterior zum Bregmapunkt) gemäß der Aufforderung der digitalen Anzeige (Abbildung 1E).
8. Bohren Sie mit einer 1 mL Spritzennadel (26 G, 0,45 mm) langsam ein kleines Bohrloch durch den Schädel, ohne in die Dura einzudringen (Abbildung 1F). Führen Sie die Mikroliter-Spritzennadel langsam durch das Loch in das Hirngewebe ein, bis eine bestimmte Tiefe erreicht ist (z = -1,62 mm für die meisten P56-Mäuse) (Abbildung 1G).
   HINWEIS: Empirisch ermöglicht die Einstichtiefe von -1,62 mm, dass die Nadelspitze bei den meisten P56-Mäusen die Mitte des Corpus callosum erreicht, so dass das Lysolecithin direkt in das Corpus callosum abgegeben werden kann, um eine Demyelinisierung zu induzieren.
9. Injizieren Sie 1,5 μl 1 % Lysolecithin mit einer Geschwindigkeit von 0,3 μl/min. Warten Sie nach der Injektion 5 Minuten, bevor Sie die Mikroliterspritze langsam herausziehen, um ein Austreten von Flüssigkeit entlang des Injektionsnadelwegs zu verhindern.
10. Nähen Sie die Haut mit 5-0 chirurgischen Nähten (Abbildung 1H).
11. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um einen Abfall der Körpertemperatur zu vermeiden. Verabreichen Sie alle 24 Stunden eine subkutane Injektion von 5 mg/kg Carprofen, um die Schmerzen zu lindern. Tragen Sie jeden Tag Erythromycin-Salbe auf den Schnitt auf, um sicherzustellen, dass die Wunde richtig heilt. Setzen Sie die operierte Maus allein in einen Käfig und füttern Sie sie mit feuchtem Futter, bis sie sich vollständig erholt hat. Überwachen Sie die Maus täglich nach der Operation.

2. Vorbereitung der osmotischen Pumpe

HINWEIS: Die Schlüsselkomponenten der Pumpe sind in Abbildung 2A dargestellt.

1. Bestimmen Sie die Einführtiefe der Gehirninfusionskanüle in das Gehirn. Stellen Sie sicher, dass die Nadel der verwendeten Gehirninfusionskanüle 3 mm lang ist und jeder Abstandshalter zur Tiefeneinstellung 0,5 mm lang ist. Um eine Injektionstiefe von 1,5 mm (nahe dem Kallosum) zu erreichen, befestigen Sie drei Abstandshalter zur Tiefenverstellung mit Gewebekleber an der Nadel der Hirninfusionskanüle (Abbildung 2B, C).
2. Um die osmotische Pumpe zu füllen, befestigen Sie die mit dem Pumpenpaket gelieferte Spritzennadel an einer 1-ml-Spritze und aspirieren Sie das Medikament. Halten Sie die Pumpe aufrecht, führen Sie die Spritze in die Öffnung oben an der Pumpe ein und injizieren Sie das Arzneimittel langsam, wobei Sie darauf achten, dass keine Blasen entstehen (siehe Abbildung 2D). Wenn die Flüssigkeit aus der Öffnung fließt, ziehen Sie die Spritze langsam heraus.
3. Entfernen Sie den weißen Flansch mit einer Schere oder Zange vom Durchflussregler und achten Sie darauf, den Strömungsregler nicht zu verbiegen oder zu quetschen. Setzen Sie dann den Strömungsmesser in die Pumpe ein (Abbildung 2E). Um festzustellen, ob sich Blasen in der osmotischen Pumpe befinden, wiegen Sie die osmotische Pumpe vor und nach der Befüllung getrennt.
4. Schneiden Sie den Katheter auf eine bestimmte Länge entsprechend der Größe des Tieres ab (20-25 mm Katheter für P56-Mäuse, die etwa 25 g wiegen). Befestigen Sie den Katheter an der Infusionskanüle des Gehirns.
5. Füllen Sie den Katheter mit Medikamenten, indem Sie die Spritze verwenden, ohne Luft einzuführen (Abbildung 2F).
6. Verbinden Sie den Katheter mit dem Strömungsmoderator. Stellen Sie nach dem Anlegen sicher, dass der Katheter etwa 4 mm des freiliegenden Flussmoderators abdeckt (Abbildung 2G).
7. Um sicherzustellen, dass die osmotische Pumpe sofort nach der Implantation arbeiten kann, tauchen Sie die gefüllten Pumpen mindestens 4 bis 6 Stunden lang in sterile 0,9%ige Kochsalzlösung oder PBS bei 37 °C (vorzugsweise über Nacht), um die semipermeable Membran auf der Pumpenoberfläche mit Lösungen vorzubenetzen, die den gleichen osmotischen Druck wie die Gewebeumgebung haben (Abbildung 2H).
8. Alle Lösungen, die in die Pumpen geladen werden, sollten steril sein. ALZET-Pumpen werden steril geliefert, nachdem sie einer sterilisierenden Dosis von Kobalt-60 ausgesetzt wurden. Kommt es jedoch zu Verunreinigungen von außen, kann die Oberfläche der Pumpe durch Abwischen mit Isopropylalkohol (70 % Wasser) gereinigt werden.

3. Implantation der osmotischen

1. Pumpe Warten Sie 3 Tage nach der Etablierung des Corpus-Callosum-Demyelinisierungsmodells. Schalten Sie das Anästhesiesystem für Kleintiere ein. Desinfizieren Sie Scheren, Pinzetten und hämostatische Zangen und tränken Sie sie in 75%iger Alkohollösung. Legen Sie sterile Tücher in den Operationsbereich.
2. Betäuben Sie die Mäuse und befestigen Sie sie wieder auf dem stereotaktischen Apparat. Bedecken Sie die Oberfläche der Augäpfel mit einer Augensalbe, um Trockenheit zu vermeiden.
3. Desinfizieren Sie die ursprüngliche Wunde mit 75% Alkohol. Öffnen Sie den chirurgischen Schnitt, der zuvor genäht wurde (Abbildung 3A), und erweitern Sie den Schnitt bis zu den Schulterblättern (Abbildung 3B).
4. Trennen Sie die Haut vom subkutanen Bindegewebe mit einer hämostatischen Zange oder Pinzette am Schulterblatt, um einen Hohlraum zu öffnen (Abbildung 3C). Setzen Sie die osmotische Pumpe in den Hohlraum ein (Abbildung 3D, E).
5. Wischen Sie mit einem Wattestäbchen vorsichtig das Nadelloch auf der Schädeloberfläche ab und legen Sie es frei, das bei der Etablierung des Demyelinisierungsmodells entstanden ist (siehe Schritt 1.8). Führen Sie die Gehirninfusionskanüle senkrecht durch dieses Nadelloch ein und befestigen Sie sie schnell mit Gewebekleber am Schädel (Abbildung 3F).
6. Entfernen Sie die abnehmbare Lasche über der Hirninfusionskanüle mit einer Schere (Abbildung 3G, H). Alternativ können Sie vor dem Einsetzen der Kanüle zuerst die Lasche entfernen, um ein Schütteln während dieses Vorgangs zu vermeiden.
7. Nähen Sie den Schnitt oder befestigen Sie ihn mit Gewebekleber (Abbildung 3I).
8. Legen Sie die Maus nach der Operation auf ein Heizkissen, um einen Abfall der Körpertemperatur zu vermeiden. Verabreichen Sie alle 24 Stunden eine subkutane Injektion von 5 mg/kg Carprofen, um die Schmerzen zu lindern. Tragen Sie jeden Tag Erythromycin-Salbe auf den Schnitt auf, um sicherzustellen, dass die Wunde richtig heilt. Setzen Sie das Tier allein in einen Käfig und füttern Sie es mit feuchtem Futter, bis es sich vollständig erholt hat.

Ergebnisse

Abbildung 1: Etablierung des Lysolecithin-induzierten Demyelinisierungs-Mausmodells. (A) Die Maus im stereotaktischen Apparat sichern. (B) Öffnen Sie einen 1 cm langen Schnitt in der Mitte des Sagittals, um den Schädel fr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anästhesie-Luftpumpe	RWD	R510-29	E05818-006
Gehirninfusionsset 3	ALZET	8851	1-3 mm
Carprofen	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg alle 24 h
Erythromycin Auge Salbe	Entlang der Technologie	YCKJ-RJ-024780	Decken Sie die Oberfläche der Augäpfel während der Anästhesie
Erythromycin-Salbe	pythonbio	RG180
Gasevakuierungsgerät	RWD	R546W	E05518-002
L-α-Lysophosphatidylcholin	Sigma	L0906	Bei 1% mit steriler PBS-Mikroliterspritze
	auflösen Hamilton	65460-05	Spritzenserie:1700, 10 μL, 33 Gauge
Mikroosmotische Pumpe Modell 1002	ALZET	4317	0,25 μl pro Stunde, 14 Tage
PBS (pH = 7,3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital-Natrium	Shanghai Civi	CAS NO: 57-33-0	150-200 mg/kg intraperitoneale Injektion zur Euthanasie
Anästhesiegerät für Kleintiere	RWD	R520IE	E05807-006 M
Stereotaktische Ausrüstung	RWD	E06382
STERI 250 Sterilisator	Keller	31101	Schnellsterilisation von chirurgischen Instrumenten
Chirurgisches Nahtmaterial	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Spritzennadel (1 mL)	Shanghai KDL	6930197811018	26 Gauge (0,45 mm x 16 mm)
Prüfung von Arzneimitteln und Lösungsmitteln	Experimentabhängiges	N/A
Thermostar homöothermisches Überwachungssystem	RWD	69026	Aufrechterhaltung der Körpertemperatur während der Anästhesie
Vetbond Gewebekleber	3M	1469SB	Befestigen Sie die Gehirninfusionskanüle und kleben Sie den Hautschnitt

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