Intrathekale Verabreichung einer Testsubstanz an das Zentralnervensystem der Ratte

Zusammenfassung

Quelle: Chen, Y., et al. Intrathekale Verabreichung von Antisense-Oligonukleotiden im Zentralnervensystem der Ratte. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Verabreichung einer Testverbindung in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) durch einen Katheter, der in die lumbale Wirbelsäule eines Rattenmodells implantiert wurde. Die Verbindung zirkuliert entlang des Liquors zum Gehirn und zum Rückenmark, dringt in Neuronen ein und bietet therapeutisches Potenzial.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Chirurgie

1. Identifizieren Sie mit der Ratte, die von dem konischen 50-ml-Schlauch gestützt wird, die beiden natürlichen Vertiefungen zwischen den Muskeln über dem Becken (Pfeile in Abbildung 1A). Mit einer Hand, die diese Gruben hält, drücken und fühlen Sie mit der anderen Hand sanft von kaudaler zu rostraler Richtung auf die Wirbelsäule und finden Sie die erste große Vertiefung zwischen den Wirbeln, und dies ist der Zwischenwirbelraum zwischen den Wirbeln des Kreuzbeins 1 (S1) und der Lendenwirbel 6 (L6) (Abbildung 1B).
2. Bewegen Sie sich leicht rostral, um die nächste Vertiefung, den Zwischenwirbelraum zwischen den Wirbeln Lendenwirbel 5 (L5) und L6 und die Injektionsstelle (* in Abbildung 1A) zu identifizieren. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen nicht mehr als 2 cm langen Schnitt in die Haut entlang der Mittellinie von rostral nach kaudal zu machen, so dass sich die Injektionsstelle in der Mitte des Schnitts befindet (gestrichelte Linie in Abbildung 1A).
3. Verwenden Sie eine Präparierschere, um das Bindegewebe zu präparieren und die Muskelschicht sichtbar zu machen. Machen Sie dann einen 1 cm langen Schnitt in der Muskelkapsel unmittelbar lateral des dorsalen Wirbelfortsatzes der L6 Lendenwirbel.
   HINWEIS: Die Knochen des L6 Lendenwirbels konnten an dieser Stelle sichtbar gemacht werden.
4. Positionieren Sie die Führungskanüle-Nadel-Einheit in der Nähe der vorderen Seite des 6. Lendenwirbels und schieben Sie sie in den Zwischenwirbelraum entlang der vorderen Seite des 6. Wirbels, so dass das Ende der Nadel in den Spinalkanal eindringt. Schieben Sie die Führungskanüle entlang der Nadel in Position und entfernen Sie die 23-G-Nadel, wobei nur die Führungskanüle an Ort und Stelle bleibt.
   HINWEIS: Es ist hilfreich, vor dem Einführen der Nadel eine stumpfe Pinzette zu verwenden, um den dorsalen Fortsatz des L6-Lendenwirbels zu lokalisieren. Im Allgemeinen kann man sehen, wie Liquor cerebrospinalis (CSF) in die Nadelnabe eindringt (diese Flüssigkeit kann mit einem Hauch von Blut gefärbt sein, aber dies bedeutet nicht, dass ein Schaden angerichtet wurde oder dass die Nadel nicht richtig platziert ist). Die Autoren haben während dieses Eingriffs keine große Menge Blut oder schwere Blutungen gesehen. In jedem Fall sollte ein Tierarzt kontaktiert werden, um die geeignete Behandlung zu bestimmen und zu bestimmen, ob die Tiere eingeschläfert werden sollten.
5. Führen Sie die Katheterdraht-Einheit in die Führungskanüle ein. Winkeln Sie die Katheter-Draht-Einheit in einem Winkel von ca. 45° zum Wirbelkanal ab und drücken Sie das Ende ca. 0,3 cm in den Wirbelkanal.
6. Entfernen Sie die Führungskanüle und lassen Sie den Katheter mit dem Mandarindraht an Ort und Stelle. Entfernen Sie den Mandarindraht etwa 2,5 cm von der intrathekalen Spitze des Katheters entfernt und schieben Sie den Katheter in den Spinalkanal vor, bis sich die 2 cm Markierung am Eingang des Kanals befindet (gerade sichtbar unterhalb des Muskels), wie in Abbildung 2Bvi gezeigt.
   HINWEIS: Der eingeführte Katheter sollte sich rostral in den Subarachnoidalraum erstrecken. Eine erfolgreiche Platzierung sollte es dem Katheter ermöglichen, sich in diesem Raum frei zu bewegen.
7. Ziehen Sie den Mandrindraht vollständig zurück, und es kann zu sehen sein, dass Liquor in den implantierten Katheter eintritt.
8. Verbinden Sie die Einführkatheterbaugruppe über das 30-G-Nadelende mit dem distalen Ende des implantierten Katheters (Abbildung 2Bv, vi).
9. Laden Sie 60 μl sterile Kochsalzlösung in eine 100 μl Spritze (Spülspritze). Laden Sie einen Bolus von 30 μl der Testverbindung (z. B. Antisense-Oligonukleotid oder ASO-Lösung) in eine zweite Spritze (Injektionsspritze).
10. Verbinden Sie die Spülspritze (mit Kochsalzlösung beladen) mit dem Schlauchadapterende der Einführkatheterbaugruppe (Abbildung 2Bv). Injizieren Sie 20 μl sterile Kochsalzlösung in den intrathekalen Raum (Spülung vor der Injektion).
11. Verbinden Sie die Injektionsspritze (mit Testmasse beladen) mit dem Schlauchadapterende der Einführkatheterbaugruppe (Abbildung 2Bv). Injizieren Sie 30 μl der Testverbindung über einen Zeitraum von 30 s in den intrathekalen Raum.
    HINWEIS: Das routinemäßige Injektionsvolumen von ASO beträgt 30 μl, um einen guten Knockdown im Rückenmark und in der Hirnrinde zu erreichen. Es wurde berichtet, dass die Injektionsvolumina die Verteilung der Verbindung beeinflussen können, obwohl unterschiedliche Injektionsvolumina nicht getestet wurden. Wenn eine andere Verbindung oder ein anderes Volumen verwendet wird, müssen die Sicherheit und Wirksamkeit empirisch bestimmt werden.
12. Wiederholen Sie Schritt 1.10 und spülen Sie den Katheter mit weiteren 40 μl steriler Kochsalzlösung (Spülung nach der Injektion). Trennen Sie dann die Einführkatheterbaugruppe vom implantierten Katheter.
    HINWEIS: Es wird angenommen, dass die Spülung vor und nach der Injektion die lokale Sequestrierung der Verbindungen reduziert und ihre Verteilung auf die rostralen Strukturen verbessert.
13. Um den implantierten Katheter aseptisch zu schneiden und heiß zu versiegeln, legen Sie eine sterile Dissektionszange in einen Bead-Sterilisator, bis sie sehr heiß ist, und klemmen Sie sie dann mit dem heißen Ende der Pinzette auf den Schlauch.
    HINWEIS: Dadurch schmilzt der Katheter. So kollabiert das Loch im Rohr und alle Seiten kleben aneinander, wodurch der Schlauch aseptisch abgedichtet wird. Dann wird es in den subkutanen Raum eingeführt.
14. Verwenden Sie resorbierbare monofile Nähte, um den verbleibenden heißversiegelten Katheter am Bindegewebe zu befestigen. Verwenden Sie dann nicht resorbierbare monofile Nähte, um die Haut über dem gesicherten, heißversiegelten Katheter zu schließen.
    HINWEIS: Wundclips können auch gemäß dem Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) verwendet werden. Die Technik ist mit wiederholten Injektionen kompatibel, obwohl sie bisher nur für einmalige Injektionen in unsere Hände verwendet wurde. Die Durchführbarkeit wiederholter Injektionen sollte mit Zustimmung der IACUC empirisch evaluiert werden.
15. Verwenden Sie Gaze und Kochsalzlösung, um das Blut von der Haut zu waschen, und lassen Sie das Tier sich von der Narkose in einem beheizten Inkubator erholen, bis es mobil ist, woraufhin es in seinen Heimatkäfig (zwei Ratten pro Käfig) zurückgebracht wird.
    HINWEIS: Wenn Sie am selben Tag mehrere Ratten operieren, reinigen Sie die Werkzeuge mit Wasser, um das Blut zu entfernen, und sterilisieren Sie es erneut mit einem erhitzten Trockenperlensterilisator (mindestens 20 s, mit Zeit zum Abkühlen) zwischen den Tieren. Für jeweils 5 Tiere wird ein neuer Instrumentensatz verwendet.
16. Überwachen Sie die Tiere täglich für mindestens 3 Tage nach der Operation und überwachen Sie sie weiterhin wöchentlich nach der Operation, gemäß dem IACUC-Protokoll.

Ergebnisse

Abbildung 1: Identifizierung der Injektionsstelle und der Schnittlinie. (A) Wenn der Bauch der Ratte von einem konischen 50-ml-Schlauch gestützt wird, sind die beiden Vertiefungen zwischen den Muskeln über dem Becken leicht zu erkennen (Pfeile). (B) Halt...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BD Intramedic PE Schlauch	BD	Polyethylen Schlauch PE50, Durchmesser 0.023 in	BD 427400 (10 ft, Fischer Scientific 22-204008) oder 427401 (100 ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD Intramedic PE Schlauch	BD	Polyethylen Schlauch PE10, Durchmesser 0,011 Zoll	BD 427410 (10 ft, Fischer Scientific 14-170-11B) oder 4274011 (100 ft, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD PrecisionGlide Einwegnadeln 30G	BD		BD 305128
Führungskanüle	BD	19G x 1 WT (1,1 mm x 25 mm) Nadel	BD 305186
Hamilton Spritze 100 ul	Hamilton Company	Hamilton Spritze 100 ul
Heißperlensterilisator	Fein Science Tools		Sterilisator Modell-Nr. FST 250
Povidon-Peeling	PDI		S48050
Kochsalzlösung	Baxter	Natriumchlorid 0,9% intravenöse Infusion BP 50 ml	FE1306G
Skalpell	Feder	Einweg-Skalpell	Nr. 10
Heizkissen für Kleintiere	K&H Herstellung		Modell-Nr. 1060
Mandrettedraht	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Handtuchtuch für die Chirurgie	Dynarex		4410
Chirurgische Schere und Zange	FST und Fisher Scientific
Nahtmaterial	Ethicon		4-0 oder 5-0
Alternative Quelle für vorgefertigte und sterilisierte Materialien für dieses Verfahren
Dosierkatheter System	SAI Infusionssysteme		RIDC-01
Führungskanüle	SAI Infusionssysteme		RIDC-GCA
Interne Katheter	SAI Infusionssysteme		RIDC-INC
Stilettdraht	SAI Infusionssysteme		RIDC-STY