Beurteilung der Atmosphärendruck-Plasmabehandlung in Neuroblastomzellen mit Glukosemangel

Zusammenfassung

Quelle: Yan, X., et. al., Neue Anwendung eines Atmosphärendruck-Plasmastrahls als neuroprotektives Mittel gegen Glukoseentzugs-induzierte Schädigung von SH-SY5Y-Zellen. J. Vis. Exp. (2017)

Das Video zeigt die neuroprotektive Aktivität der niedrig dosierten Atmosphärendruck-Plasmabehandlung in Neuroblastomzellen mit Glukosemangel, indem sie oxidativen Stress moduliert und die Lebensfähigkeit der Zellen verbessert.

Protokoll

1. APPJ-Behandlung (Atmospheric Pressure Plasma Jet) von SH-SY5Y

1. Stellen Sie den Abstand zwischen der Düse des Quarzrohrs und der Plattform, auf der die 96-Well-Platte platziert wird, auf 3 cm ein. Stellen Sie sicher, dass der Strahl die Oberfläche des Kulturmediums berühren kann.
   HINWEIS: Der Abstand wird nicht von der Unterseite der Platte gemessen. Er wird zunächst auf 3 cm zwischen der Düse des Quarzrohrs und der Plattform eingestellt, auf der die 96-Well-Platte platziert wird.
2. Wechseln Sie vor der APPJ-Behandlung (Atmospheric Pressure Plasma Jet) das Kulturmedium in jeder Vertiefung mit Ausnahme der Kontrollvertiefungen auf RPMI 1640 ohne Glukosemedium.
3. Platzieren Sie die Platte unter der APPJ-Düse und stellen Sie sicher, dass die Düsen vertikal in jede Vertiefung schießen können.
4. Behandeln Sie Zellen in separaten Vertiefungen mit APPJ für 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s und 12 s.
   HINWEIS: APPJ wird durch ionisierendes Helium erzeugt (Abbildung 1). Die durch Glukoseentzug verletzten Zellen werden mit einem Heliumfluss von 4 s und 8 s behandelt, um die Auswirkungen von Helium auf die Zellen zu beseitigen. Alle Behandlungen sollten in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden.

2. Zellviabilitätsassay

HINWEIS: Wechseln Sie das Medium in diesem Schritt nicht.

1. Nach der APPJ-Behandlung inkubieren Sie die Zellen für 1 h in einem Zellinkubator.
2. Geben Sie 10 μl Lösung des Cell Counting Kit-8 (CCK-8) in jede Vertiefung
.
3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 4 h.
   HINWEIS: Die SH-SY5Y-Zelllinie reagiert empfindlich auf Glukosemangel. Die Zellviabilität sinkt nach 1 h Glukoseentzug auf fast 50%, was die optimale Bedingung für die Zellviabilität für pharmakodynamische Studien ist. CCK-8 hat keine Zytotoxizität für Zellen, und die Zellen werden nach der APPJ-Behandlung weitere 4 Stunden lang unter Glukoseentzugsbedingungen mit CCK-8-Reagenz inkubiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen. Nach 8 Stunden Glukoseentzug und APPJ-Behandlung war die schützende Wirkung von APPJ signifikant reduziert, da die lange Dauer des Glukoseentzugs zu einer schweren Schädigung der SH-SY5Y-Zellen führte. Es gab keine Hinweise auf lebende Zellen nach 24 Stunden Glukoseentzug.
4. Messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.

Ergebnisse

Abbildung 1: Typische RNS- (Reaktive Stickstoffspezies) und ROS (Reaktive Sauerstoffspezies) Reaktionen in APPJ-Emissionen (Atmospheric Pressure Plasma Jet).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SH-SY5Y cell line	China Center for Type Culture Collection	3111C0001CCC000026
RPMI 1640 medium	Thermo Scientific	21875091	gelagert bei 4 °C
RPMI 1640 medium keine Glukose	Thermo Wissenschaftliche	11879020	Lagerung bei 4 °C
Fötales Kälberserum	Thermo Scientific	16000044	Lagerung bei -20 °C
96 Vertiefungen Plate	Corning	3599
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories	CK04	Lagerung bei 4 °C
Mikroplatten-Reader	Tecan	M200 Pro	Zur Messung der Extinktion bei 450 nm
Hochspannungs-Leistungsverstärker	Trek	PD06087	Zur Verstärkung der Stromversorgung
Funktion Signalgenerator	MaZe Electronics Science&Technology	AT30120	Zur Bereitstellung des spezifischen Signals
Hochspannungssonde	Tektronix	P6015A	Zur Detektion von Hochspannung
Digitales Oszilloskop	Tektronix	DPO4104B	Zur Anzeige des Signals