Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen

Zusammenfassung

Eine einfache und bequeme Methode, um das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen zu bestimmen, ist beschrieben. Diese Technik ermöglicht es, die Funktion der elektrischen Synapsen zwischen Nervenzellen im intakten Netzhaut unter verschiedenen Lichtverhältnissen und zu verschiedenen Zeiten des Tages und der Nacht zu untersuchen.

Zusammenfassung

Neben der chemischen synaptischen Übertragung, können Neuronen, die durch Gap Junctions miteinander verbunden sind auch schnell kommunizieren über elektrische synaptische Übertragung. Zunehmende Hinweise darauf, dass Gap Junctions ermöglichen nicht nur elektrischen Strom fließen und synchrone Aktivität zwischen miteinander verbundenen oder gekoppelten Zellen, sondern dass die Stärke oder die Wirksamkeit der elektrischen Kommunikation zwischen gekoppelten Zellen moduliert werden kann zu einem großen Teil ^1,2. Darüber hinaus ermöglicht der große Innendurchmesser (~ 1,2 nm) von vielen Gap Junction Kanälen nicht nur elektrischen Strom fließen, sondern auch die Diffusion von intrazellulären Signalmolekülen und kleinen Metaboliten zwischen miteinander verbundenen Zellen, so dass Gap Junctions kann auch vermitteln, metabolische und chemische Kommunikation . Die Stärke der Lücke junctional Kommunikation zwischen Neuronen und deren Modulation durch Neurotransmitter und andere Faktoren können durch die gleichzeitige Aufnahme von elektrisch gekoppelt Zellen und durch die Bestimmung t untersucht werdenEr Ausmaß der Verbreitung von Tracer-Moleküle, die Gap Junction durchlässig sind, aber nicht durchlässige Membran nach iontophoretischen Injektion in einzelne Zellen. Allerdings können diese Verfahren äußerst schwierig, auf Neuronen mit kleinen Somata in intakten Nervengewebe führen.

Zahlreiche Studien über elektrische Synapsen und die Modulation der elektrischen Kommunikation wurden in der Wirbeltier-Netzhaut durchgeführt worden, da jeder der fünf retinalen Neuronen-Typen erfolgt elektrisch über Gap Junctions ^3,4 verbunden. Zunehmende Anzeichen hat gezeigt, dass die circadiane (24-Stunden-) Uhr in der Netzhaut und Veränderungen in Lichtstimulation Gap Junction Kopplung ^3-8 regulieren. Zum Beispiel, haben neuere Arbeiten gezeigt, dass die Netzhaut circadianen Uhr Gap Junction Kopplung zwischen Stäbchen und Zapfen Sehzellen sinkt im Laufe des Tages durch die Erhöhung Dopamin D2-Rezeptor-Aktivierung und erhöht drastisch Stäbchen-Zapfen-Kopplung in der Nacht durch die Reduzierung D2-Rezeptor-Aktivierung Hier stellen wir eine einfache Methode zur Bestimmung des Ausmaßes der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen unter verschiedenen Lichtverhältnissen und zu verschiedenen Zeiten des Tages und der Nacht. Dieser Schnitt-loading-Technik ist eine Modifikation des kratzen loading ^9-12, die auf Farbstoff Be-und Diffusion durch offene Gap Junction Kanälen basiert. Scrape Laden funktioniert gut in kultivierten Zellen, aber nicht in dicke Scheiben schneiden, wie intakte Netzhaut. Der Schnitt-loading-Technik wurde verwendet, um Photorezeptor-Kopplung in intakten Fisch und Säugetier-Retina ^{7, 8,13} studieren, und kann verwendet werden, um studieren Kopplung zwischen seinanderen retinalen Neuronen, wie hier beschrieben.

Protokoll

1. Intact neuronalen Retina-Präparaten für Goldfische, Mäuse und Kaninchen

1. Führen Sie alle folgenden Schritte, einschließlich derer im Abschnitt "2) Cut-loading", bei konstanten Umgebungsbedingungen (Hintergrund-) Beleuchtung. Bitte beachten Sie, dass für die Zwecke dieses Protokolls, die Verfahren beschrieben werden, wie ausgeführt in konstanter Dunkelheit (dh unter sehr dunklen (dh "skotopischen") Bedingungen ≤ 0,0001 lux) mit Nachtsicht Infrarot-Brille, sondern auch andere höhere Intensitäten der konstanten Umgebungsbeleuchtung können stattdessen verwendet werden, um die Wirkung von anderen Ebenen der Umgebungsbeleuchtung auf Gap Junction-Tracer-Kopplung zu bestimmen.
2. Dark-Anpassung des Versuchstieres (Goldfische, Maus oder Kaninchen) für mindestens 1 Stunde vor der Operation.
3. Wie zuvor beschrieben ^7, tief betäuben Goldfische, indem man sie in Tricaine Methansulfonat (MS222, 150 mg / l gepuffert (Natrium-Bicarbonat-haltigen) Aquarium Wasser), und tief betäuben Mäuse mit Ketamin (100 mg/ Kg, ip) und Rompun (10 mg / kg, ip). Tief betäuben Kaninchen mit Urethan (Loading dose: 2,0 g / kg, ip) und auch lokale intraorbitale Anästhesie (2% Xylocain), wie zuvor beschrieben ^8. Alle Experimente, die die Pflege und Nutzung von Tieren im Einklang mit Bundes-Richtlinien durchgeführt und überprüft und von den örtlichen Universität Tier in Pflege und Gebrauch Ausschüsse genehmigt werden. (Hinweis:. In den Experimenten hier beschrieben, alle experimentellen Verfahren, die die Pflege und Nutzung der Fische, Mäuse und Kaninchen wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien durchgeführt und wurden überprüft und genehmigt von der Ohio State University Institutional Animal Care und Verwenden Committee)
4. Für Fische, Mäuse und Kaninchen, nach Enukleation, entfernen Sie den vorderen Teil eines jeden Augapfel. Legen Sie dann ein Stück Filterpapier auf der Oberseite des hinteren Teil des Auges und invertieren die Filterpapier und Auge, so dass das Filterpapier unter dem hinteren Teil des Auges ist. Dann, mit feinenPinzetten sezieren die intakte neuronale Retina aus dem hinteren Teil des Auges durch leichtes Abziehen der Pigmentepithel / Aderhaut / Lederhaut, die miteinander verbunden sind, aus der neuronalen Netzhaut, die das Filterpapier angebracht ist. Als dies geschehen ist, schneiden Sie den Sehnerv mit feinen federbelastete Schere. Die neuronalen Netzhaut, orientiert Photorezeptor-side up, sollte nun auf das Filterpapier befestigt werden und getrennt vom Rest des Auges.

2. Cut-loading

1. Tauchen Sie die Netzhaut in Sauerstoff Ringer-Lösung (Tabelle 1) in einer 6-Well-Platte (~ 5 mL / well) für 30 min bei konstanten Umgebungsbedingungen (Hintergrund-) Beleuchtung (z. B. unter sehr dunklen (dh "skotopischen") Bedingungen) mit oder ohne ein Test Droge. Behalten Fisch Netzhaut in Sauerstoff (5% CO ₂ / 95% O ₂₎ Bicarbonat-basierten Ringer bei 22 ° C durch Abdichten der 6-Well-Platte mit Parafilm und pflegen Maus und Kaninchen Netzhaut bei 36 ° C in einer 5% igen CO ₂ / 95% O
2. Bereiten Sie die Tracer-Lösung (typischerweise 100 ul) durch Auflösen neurobiotin (0,5%), einem biotinylierten Moleküls, in Ringer-Lösung unmittelbar vor Durchschneiden der Netzhaut. Beachten Sie, dass 0,5% Rhodamin Dextran (hoch (> 10.000) MW) zu der Lösung hinzugefügt werden. Aufgrund seiner hohen Molekulargewicht, wird Rhodamin Dextran nicht überqueren Gap Junctions und nur Etiketten, Zellen, die durch den Schnitt beschädigt wurden. Wie in Abb.. 3, ist dies eine nützliche Methode, um Zellen, die angesammelten neurobiotin haben, weil sie verletzt wurden, von denen, die der Tracer angesammelt haben durch Diffusion durch gap junctions unterscheiden.
3. Legen Sie die neurobiotin Lösung auf ein Glas (oder Kunststoff) Petrischale, tippen Sie auf das Filterpapier, zu denen der Netzhaut angebracht ist, auf einem Papiertuch, um überschüssige Ringer entfernen, tauchen Sie ein Rasiermesser (oder andere scharfe Klinge) in der neurobiotin Lösung und dien einen radialen Schnitt durch die Netzhaut und Filterpapier. Falls gewünscht, können Abstandhalter verwendet werden, so dass der Schnitt durch die Retina wird, aber nicht das Filterpapier. Der Schnitt sollte senkrecht zu der Netzhaut. Tauchen Sie die Rasierklinge in der neurobiotin Lösung wieder und schneiden die Netzhaut ein zweites Mal. Wiederholen Sie diese bis zu 4 Schnitte pro Netzhaut (siehe Abb. 1).. Verwenden Sie ein Binokular Bei der Rasierklinge schneidet durch Maus und andere kleine Netzhaut.
4. Wie in Abb.. 1, tauchen die Netzhaut wieder in frische Ringer-Medium, mit oder ohne Testsubstanz mit einem 6-Platte gut (5 mL Ringer / well). Inkubieren der Netzhaut für 15 min bis zum Be-und Diffusion zu ermöglichen.
5. Dreimal für jeweils 5 min mit frischer Ringer-Medium mit oder ohne Testsubstanz.
6. Fix der Netzhaut mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PBS, pH 7,4) für 1 Stunde bei RT.
7. Waschen mit 0,1 M PBS über Nacht bei 4 ° C.
8. Am folgenden Tag, reagieren wit 2% Streptavidin-Alexa 488 (Endkonzentration 10 ug / ml) in 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, und halten Sie über Nacht bei 4 ° C.
9. Dreimal für jeweils 10 Minuten mit 0,1 M PBS bei RT
10. In PBS, lösen die Netzhaut vom Filterpapier und dann mit einem feinen Pinsel, Ort der Netzhaut, orientiert Photorezeptor-Seite nach oben auf eine Folie.
11. Behutsam mit Vectashield Eindeckmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) zu montieren.
12. Nehmen Sie Bilder mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop (zB Zeiss 510 META) bei gleicher Vergrößerung, Auflösung und Einstellungen für jede experimentelle Bedingung, so dass man die Auswirkungen der verschiedenen experimentellen Bedingungen (zB Test-Drogen; Lichtverhältnissen) vergleichen das Ausmaß der Gap Junction-Tracer-Kopplung (Abb. 2a-c und Abb.. 4A-C). Obwohl ein einzelnes Bild all der markierten Zellen enthalten kann, ist es empfehlenswert, dass Sie ein z-Stapel im Bereich der Erhebung von Zinsen und Zusammenbruch in einen einzigenBild.

3. Die Quantifizierung der Tracer-Kopplung mit ImageJ

1. In der LSM Image Browser, öffnen Sie das Bild, klicken Sie auf Exportieren und speichern Sie das Bild als TIF-16 Bit nicht komprimierte Datei. Maßstabsbalken sollte in diesem TIF-Bild aufgenommen werden.
2. Mit NIH ImageJ Software, messen Fluoreszenzintensität Alexa-488-markierten neurobiotin von Low-Vergrößerungsbildern ganzer-mount Netzhaut. Öffnen Sie die TIF-Datei mit ImageJ Software und zeichnen Sie dann eine gerade Linie entspricht der Skala bar. Zur Analyse, SET SCALE und geben Sie die bekannte Strecke und die Einheit der Länge, klicken Sie dann auf OK. Jetzt Messergebnisse können in kalibrierten Einheiten wie Millimetern vorgestellt.
3. Wählen Sie den Bereich von Interesse, wobei die rechteckige Auswahl-Werkzeug. Der Höhepunkt der Fluoreszenz sollte am linken Rand der Auswahl positioniert werden. Stellen Sie sicher, dass es keine Fluoreszenzsignal in der Nähe des rechten Rand. Wenn nicht, drehen Sie das aktive Bild (Bild, dann drehen).
4. KlickenANALYSE und PLOT PROFILE. Sie sollten eine Kurve mit einem exponentiellen Abfall von links nach rechts zu sehen.
5. Klicken Sie auf Kopieren in dem Popup-Fenster und fügen Sie ihn in EXCEL. Nun sehen Sie zwei Spalten zeigen die Entfernung aus dem Schnitt (linke Spalte) und die Fluoreszenz-Intensität als Funktion des Abstandes vom Schnitt (rechte Spalte).
6. Teilen Sie jeden Rohstoff Fluoreszenz-Wert durch die maximale Fluoreszenz Wert für die relative Fluoreszenzintensität zu erhalten.
7. Kopieren Sie zwei Spalten entsprechend dem Abstand von der Schnittkante (X) und die relative Fluoreszenzintensität (Y), und fügen Sie sie in Origin Software.
8. Fit mit dem exponentiellen Nr. 1 Funktion (Abb. 2D-und 4D-Bild.), Die in das Formular:
   Y = Y ₀ + Y _max * exp ^{(-x / λ)}
   wobei Y die relative Fluoreszenzintensität ist, Y _o die Hintergrundfluoreszenz ist, Y _max die maximale relative Fluoreszenz ist, ist λ die space (Länge) konstant, und x ist der Abstand von der Schnittkante.
9. Vergleichen Sie den Raum konstant (λ)-Werte bei verschiedenen experimentellen Bedingungen mit dem t-Test oder ANOVA (Abb. 2E und Abb.. 4E). Beachten Sie, dass alternative Techniken der Quantifizierung von anderen ^13,14 beschrieben worden.

4. Repräsentative Ergebnisse

Repräsentative Beispiele für Photorezeptorzelle Tracer Kopplung von cut-Laden bestimmt sind in den Abbildungen 2 und 3 (Fisch) und Abbildung 4 (Kaninchen) vorgestellt. Konfokale Bilder wurden mit den gleichen Einstellungen für den Vergleich (Abb. 2a-c und Abb.. 4A-C) und die Fluoreszenz-Intensität als Funktion des Abstandes von der Schnittfläche aufgetragen und montiert durch die Exponentialfunktion in Ziffer 3.8 oben gezeigt (Abb. 2D und Bild. 4D). Raum konstante Werte für jede Bedingungsind in den Abbildungen 2E und 4E gezeigt, veranschaulicht, dass das Ausmaß der Gap Junction-Tracer-Kopplung quantifiziert werden mit Hilfe der Schnitt-loading-Technik sein. Darüber hinaus werden die Ergebnisse in hohem Maße reproduzierbar. Die Nutzung der Schnitt-loading-Technik als Mittel zur Quantifizierung der Umfang der Gap Junction-Tracer-Kopplung ist auch der Befund, dass die Fluoreszenz-Intensität exponentiell abnimmt als Funktion des Abstandes von der Schnitt in allen Fällen überprüft untersuchten ^7,8 (siehe auch Abb.. 2D-und 4D hier), was darauf hinweist, dass neurobiotin die Photorezeptoren trat über die Rasierklinge geschnitten und nicht von anderen retinalen Seiten. Auch die qualitativ ähnliche Tag / Nacht-Unterschied in Photorezeptorzelle Tracer-Kopplung in Goldfische mit Tracer-Injektionen in einzelne Kegel und mit cut-loading ⁷ beobachtet begründet cut-Laden als ein relativ genaues Mittel zur Bestimmung des Ausmaßes der Photorezeptor-Kopplung.

Der Cut-loading Technik kann auch verwendet werden, um andere Arten von elektrischen Synapsen in der Retina zu untersuchen. Zum Beispiel zeigt Abbildung 5, dass Kaninchen A-Typ (Abb. 5A) und B-Typ (Abb. 5B) horizontale Zellen weisen homologe Tracer Kopplung folgenden Schnitt-loading und Verbreitung von neurobiotin unter dunkeladaptierten Bedingungen.

Verbindung	Fisch	Maus	Kaninchen
NaCl	130	120	117
NaHCO 3	20	25	30
NaH 2 PO 4	-	1	0,5
KCL	2,5	5	3,1
Glucose	10	10	10
MgCl 2	1	-	-
MgSO 4-7H 2 O	-	1	1,2
Glutamin	-	0,1	0,1
CaCl 2	0,7	2	2

Tabelle 1: Zusammensetzung der Ringer-Lösungen für Goldfische, Maus und Kaninchen Netzhaut. Die Konzentrationen sind in mM vorgestellt. Die Ringer-Lösungen werden mit 5% CO ₂ / 95% O ₂ Blasen und bei 22 ° C (Fisch) oder 36 ° C (Säugetiere). "-": Nicht in der Ringer für diese Spezies enthalten.

Abbildung 1:. Flussdiagramm, das die cut-Ladevorgang. Nach der Isolierung of der intakten neuronalen Netzhaut wurden mehrere radiale Schnitte durch eine Klinge, die zuerst in 0,5% neurobiotin Lösung getaucht wurde gemacht. Die Netzhaut wurde für Tracer Be-und Diffusions-inkubiert, und dann vor der Fixierung mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) gewaschen. Tracer-Kopplung wurde mittels Streptavidin-konjugierte Alexa-488.

Abbildung 2. Tag-Nacht-Unterschied in der Photorezeptor-Tracer-Kopplung in Goldfisch ist durch den Schnitt-loading-Technik aufgedeckt. Photorezeptorzelle Gap Junction neurobiotin Tracer-Kopplung wurde in der Nacht (B) und in den Tag umfangreichen folgende Anwendung Spiperon (10 pM), ein selektiver Dopamin-D _{2-Rezeptor-Antagonist} (C), aber nicht in den Tag unter Kontrollbedingungen (A). D) normalisierte relative Fluoreszenzintensität als Funktion des Abstandes von der Schnitte (durch Pfeile angedeutet in AC). E) Space konstant valWerte aus den Daten in D und anderen Experimenten (n = 4). *** P <0,001.

Abbildung 3. Ein repräsentatives Beispiel zeigt Fluoreszenz in den Sehzellen Schicht eines dunkeladaptierten Goldfisch Netzhaut in der Nacht nach cut-Laden mit einer Lösung sowohl neurobiotin und Rhodamin Dextran. Rhodamin Dextran (rot dargestellt), die nicht durch offene Gap Junction Kanälen aufgrund seiner hohen Molekulargewicht (> 10.000 MW), nur markierte Zellen in der Nähe der Schnitt ist diffus. Im Gegensatz dazu kann neurobiotin (grün dargestellt) verbreitet über Gap Junctions und in Sehzellen weit von dem Schnitt zu sehen. Die Lage des Schnittes wird durch den Pfeil in jedem Panel angezeigt. Maßstab: 200 um.

Abbildung 4. Tag-Nacht-UnterschiedePräsenz in Photorezeptor Tracer-Kopplung in Kaninchen Netzhaut ist durch den Schnitt-loading-Technik aufgedeckt. Photorezeptorzelle Gap Junction neurobiotin Tracer-Kopplung wurde in der Nacht (B) und in den Tag umfangreichen folgende Anwendung Spiperon (10 pM) (C), aber nicht in den Tag unter Kontrollbedingungen (A). In AC, stehen senkrecht Ansichten der 3D-Rekonstruktion von Kaninchen-Photorezeptoren in der Nähe der Schnitt dargestellt. D) normalisierte relative Fluoreszenzintensität als Funktion des Abstandes von der Schnitte. E) Space konstante Werte aus den Daten in D und anderen Experimenten (n = 3). *** P <0,001.

Abbildung 5. Cut-loading zeigt, dass dunkeladaptierten Kaninchen horizontalen Zellen sind Tracer gekoppelt. Beide A-Typs (A) und B-Typ (B) horizontale Zellen in dunkeladaptierten Kaninchen Netzhaut ausgestellt homologen neurobiotin Tracer-Kopplung.

Diskussion

Der Schnitt-loading hier beschriebene Methode ist ein nützliches und einfach Technik, um das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen unter verschiedenen Lichtverhältnissen und zu verschiedenen Zeiten des Tages und der Nacht zu bestimmen. Vorteile dieser Technik sind die Fähigkeit, das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Neuronen im intakten Retina unter einer Vielzahl von Beleuchtungs-Bedingungen zu quantifizieren während der Tag und Nacht und zu tun für die gekoppelte Neuronen, die mit kleinem Durchmesser Somata haben. Einschränkungen der Technik in das Studium der Gap Junctions in intaktem Gewebe fallen in zwei allgemeine Kategorien. Erstens kann Tracerdiffusion durch offene Gap Junctions relativ schwierig zu beobachten, durch a) den kleinen Durchmesser oder die Ladung mit den offenen Kanälen und b) die relativen Mengen von gekoppelten zellulären Kompartimenten ^1,14,15 verbunden. Das heißt, Tracerdiffusion aus einer kleinen Zelle, um eine größere Zelle oder Gruppe von gekoppelten Zellen, compARED zu Tracerdiffusion aus einer größeren Zelle auf eine kleinere Zelle, kann schwieriger festzustellen, da Tracer Verdünnung. Zweitens, unter bestimmten physiologischen Bedingungen kann das Ausmaß der Tracer-Diffusion durch gap junctions in intaktem Gewebe nicht genau die Stärke der Lücke junctional Leitfähigkeit aufgrund der Unterschiede in der Leitfähigkeit von kleinen elektrischen Strom führenden Ionen, verglichen mit der Durchlässigkeit der relativ großen Tracer Moleküle ^1,14,15. In der Regel Hinweise auf Tracer-Kopplung stark darauf hin, das Vorhandensein von funktionierenden, offenen Gap Junction Kanälen, sondern unter bestimmten physiologischen Bedingungen Tracerdiffusion kann nicht auftreten, oder beobachtet werden, obwohl elektrophysiologische Ableitungen der Anwesenheit von funktionierenden, offenen Gap Junctions vorschlagen.

Es scheint wahrscheinlich, dass der Schnitt-loading-Technik kann auch verwendet werden, um das Ausmaß der Gap Junction-Tracer Kopplung zwischen Neuronen im intakten Gewebe aus anderen Regionen des zentralen Nervensystems zu untersuchentem.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Tricaine Methansulfonat (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040	150 mg / l gepuffert Aquarium Wasser
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	2 g / kgloading Dosis
Dual-Rohr Night Vision Goggle	Nacht Optics USA	D-221
Filter Paper, Grade Nr. 4	Whatman	1004-090
Feine Pinzetten, Dumont Nr. 5, Biologie, 11 cm lang	Feine Science Tools	11295-10
Feine Schere, gefedert, 8 mm Klinge, gerade	Feine Science Tools	15025-10
Neurobiotin	Vektor	SP-1120	0,5%
Streptavidin-konjugierten Alexa 488	Invitrogen	S11223	2%
Dextran Rhodamin (hoch (> 10.000) MW)	Invitrogen	D1817	0,5%
Vectashield Eindeckmedium	Vektor	H-1000
Zeiss 510 META Laser Scanning Konfokalmikroskop	Carl Zeiss, Inc.
LSM-5 Image Browser 3,2,0,115	Carl Zeiss, Inc.
ImageJ Software	NIH
OriginPro 8,0	OriginLab Corp