Summary
Une méthode facile et pratique pour déterminer l'étendue de couplage traceur fossé jonction entre les neurones rétiniens est décrite. Cette technique permet d'étudier la fonction des synapses électriques entre les neurones dans la rétine intacte sous différentes conditions d'éclairage et à différents moments de la journée et la nuit.
Abstract
En plus de la transmission synaptique chimique, les neurones qui sont connectés par des jonctions communicantes peuvent aussi communiquer rapidement via la transmission synaptique électrique. En plus de preuves indiquent que les jonctions non seulement permettent la circulation du courant électrique et l'activité synchrone entre des cellules interconnectées ou couplés, mais que la force ou l'efficacité de la communication électrique entre les cellules couplées peuvent être modulées à une grande mesure 1,2. En outre, le grand diamètre interne (~ 1,2 nm) de nombreux canaux de jonction lacunaire permet non seulement de flux de courant électrique, mais aussi la diffusion des molécules de signalisation intracellulaire et des métabolites de petites cellules interconnectées entre, de sorte que les jonctions de communication peut également servir de médiateur métaboliques et chimiques . La force de la communication entre les neurones jonctions lacunaires et sa modulation par les neurotransmetteurs et d'autres facteurs peuvent être étudiés par l'enregistrement simultanément électriquement à partir de cellules couplées et en déterminant tIl mesure la diffusion des molécules traceur, qui sont perméables jonction lacunaire, mais pas de membrane perméable, après l'injection iontophorétique en cellules simples. Toutefois, ces procédures peuvent être extrêmement difficiles à réaliser sur les neurones avec des petits corps cellulaires dans le tissu neural intact.
De nombreuses études sur les synapses électriques et la modulation de communication électrique ont été menées dans la rétine des vertébrés, puisque chacun des cinq types de neurones rétiniens est reliée électriquement par jonctions lacunaires 3,4. Plus de preuves a montré que le rythme circadien (24 heures) d'horloge dans la rétine et des changements dans la stimulation lumineuse réguler jonction lacunaire couplage 3-8. Par exemple, des travaux récents ont démontré que l'horloge circadienne rétine diminue raccord de jonction écart entre la tige et les cellules photoréceptrices cône pendant la journée, en augmentant l'activation des récepteurs dopaminergiques D2, et augmente considérablement la tige-cône de couplage de la nuit en réduisant l'activation du récepteur D2 Ici, nous présentons une méthode simple de déterminer le degré de couplage traceur fossé jonction entre les neurones rétiniens dans des conditions d'illumination différentes et à différents moments de la journée et la nuit. Cette technique du cut-chargement est une modification de chargement gratter 9-12, qui est basé sur le colorant de charge et de diffusion à travers l'ouverture de canaux de jonction écart. Grattez de chargement fonctionne bien dans des cellules en culture, mais pas en tranches épaisses comme les rétines intactes. La technique du cut-chargement a été utilisée pour étudier couplage des photorécepteurs dans les poissons et les mammifères intactes des rétines 7, 8,13, et peut être utilisé pour étudier le couplage entred'autres neurones de la rétine, comme décrit ici.
Protocol
1. Intact préparation rétine neurale pour les poissons rouges, les souris et les lapins
- Effectuez toutes les étapes suivantes, y compris ceux décrits dans "2) Coupez-loading», sous ambiante constante (au fond) d'illumination. S'il vous plaît noter que pour les fins du présent protocole, les procédures sont décrites comme étant effectuées dans l'obscurité constante (c'est à dire sous très sombre (c'est à dire «scotopique») des conditions ≤ 0,0001 lux) en utilisant des lunettes de vision nocturne à infrarouge, mais d'autres niveaux d'intensité plus élevée de l'illumination ambiante constante peut être utilisé au lieu de déterminer l'effet des autres niveaux d'éclairage ambiant sur la jonction lacunaire traceur accouplement.
- Dark-adaptation de l'animal expérimental (poissons rouges, souris ou de lapin) pendant au moins 1 heure avant la chirurgie.
- Comme décrit précédemment 7, profondément anesthésier les poissons rouges en les plaçant dans tricaïne méthanesulfonate (MS222, 150 mg / L d'eau du réservoir de poissons tamponnée (bicarbonate de sodium contenant)), et profondément anesthésier les souris avec de la kétamine (100 mg/ Kg, ip) et Rompun (10 mg / kg, ip). Profondément anesthésier le lapin à l'uréthane (dose de charge: 2,0 g / kg, ip) et aussi utiliser une anesthésie locale intraorbitaire (2% Xylocaine), comme décrit précédemment 8. Toutes les procédures expérimentales impliquant le soin et l'utilisation d'animaux doit être effectué conformément aux directives fédérales et d'être examinées et approuvées par les soins des animaux de l'université locale et les comités de l'utiliser. (Remarque:. Dans les expériences décrites ici, toutes les procédures d'expérimentation impliquant le soin et l'utilisation des poissons, des souris et des lapins ont été effectuées en conformité avec les directives du NIH et ont été examinés et approuvés par l'Ohio State University en soins des animaux et du Comité institutionnel Utilisations)
- Pour les poissons, les souris et les lapins, après énucléation, retirez la partie antérieure de chaque globe oculaire. Ensuite, placez un morceau de papier filtre sur le dessus de la partie postérieure de l'œil et inverser le papier filtre et les yeux, de sorte que le papier-filtre se trouve sous la partie postérieure de l'œil. Puis, en utilisant bienpince disséquer la rétine intacte neurones de la partie postérieure de l'œil par un léger arrachement de l'épithélium pigmentaire / choroïde / sclérotique, qui sont attachés les uns aux autres, de la rétine neurale, qui est fixé sur le papier filtre. Comme cela est fait, couper le nerf optique à l'aide fines ressort des ciseaux. La rétine neurale, orientée photorécepteur vers le haut, doit maintenant être fixé sur le papier filtre et séparé du reste de l'œil.
2. Coupez-chargement
- Immerger les rétines dans une solution oxygénée Ringer (tableau 1) dans une plaque à 6 puits (~ 5 ml / puits) pendant 30 min sous ambiante constante (au fond) d'éclairage (par exemple sous très sombre (c'est à dire «scotopique») conditions) avec ou sans un médicament d'essai. Maintenir rétines de poissons dans oxygénée (5% de CO 2 / 95% O 2) à base de bicarbonate de Ringer à 22 ° C en scellant la plaque de 6 puits avec du parafilm et de maintenir la rétine de souris et le lapin à 36 ° C dans un 5% de CO 2 / 95% d'O
- Préparer la solution de traceur (typiquement 100 uL) en dissolvant neurobiotin (0,5%), une molécule biotinylée, dans la solution de Ringer immédiatement avant la coupe à travers la rétine. Notez que 0,5% de rhodamine dextrane (élevé (> 10 000) MW) peut être ajouté à la solution. Grâce à son poids moléculaire élevé, la rhodamine dextran ne traverse pas les jonctions et seulement les cellules des étiquettes qui ont été endommagés par la coupe. Comme indiqué dans la Fig. 3, c'est un moyen utile pour distinguer les cellules qui ont accumulé neurobiotin parce qu'ils ont été blessés, de ceux qui ont accumulé le traceur par diffusion à travers les jonctions communicantes.
- Placer la solution neurobiotin sur un verre (ou plastique) boîte de Pétri, appuyez sur le papier filtre, à laquelle la rétine est attaché, sur un papier absorbant pour enlever l'excès de Ringer, tremper une lame de rasoir (ou autre lame tranchante) dans la solution et neurobiotin l'n faire une coupe radiale à travers la rétine et du papier filtre. Si l'on préfère, les entretoises peuvent être utilisés de telle sorte que la coupe est faite à travers la rétine, mais pas le papier filtre. La coupe doit être orientée perpendiculairement à la surface de la rétine. Trempez la lame de rasoir dans la solution neurobiotin nouveau et couper la rétine une seconde fois. Répétez cette jusqu'à 4 coupes par la rétine (voir fig. 1). Utiliser un microscope à dissection lors des coupes de rasoir grâce à la souris et autres petits rétines.
- Comme indiqué dans la Fig. 1, submerger la rétine à nouveau dans le milieu de Ringer frais, avec ou sans médicament d'essai, en utilisant une plaque de 6 puits (5 ml Ringer / puits). Incuber la rétine pendant 15 min pour permettre le chargement et la diffusion.
- Laver trois fois pendant 5 min chacun avec un milieu de Ringer frais avec ou sans médicament testé.
- Fixer la rétine avec du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate à 0,1 M (PBS, pH 7,4) pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver avec 0,1 M PBS pendant une nuit à 4 ° C.
- Le jour suivant, réagissent wvec 2% streptavidine-Alexa 488 (concentration finale 10 pg / ml) dans 0,1 M PBS + 0,3% de Triton X-100, et de garder une nuit à 4 ° C.
- Laver trois fois chacune pendant 10 minutes avec 0,1 M de PBS à température ambiante
- En PBS, détacher la rétine du papier filtre et ensuite, en utilisant un pinceau fin, placer la rétine, orientée photorécepteur vers le haut, sur une lame.
- Doucement monter avec Vectashield milieu de montage (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
- Prenez des photos avec un microscope confocal à balayage laser (par exemple Zeiss 510 META) à l'agrandissement, la même résolution et les paramètres pour chaque condition expérimentale, afin que vous puissiez comparer les effets de différentes conditions expérimentales (par exemple test de médicaments, les conditions d'éclairage) sur l'étendue des l'écart de jonction traceur d'accouplement (Fig. 2A-C et fig. 4A-C). Bien que d'une seule image peut contenir toutes les cellules marquées, il est recommandé que vous collectez un z-stack de la zone d'intérêt et de s'effondrer en un seull'image.
3. Quantification des traceurs de couplage utilisant ImageJ
- Dans le navigateur d'image LSM, ouvrez l'image, cliquez sur Exporter et enregistrez l'image comme un peu TIF-16 PAS fichier compressé. La barre d'échelle devraient être inclus dans cette image TIF.
- Utiliser NIH ImageJ logiciels, de mesurer l'intensité de fluorescence d'Alexa-488-étiquetés neurobiotin à faible grossissement des images de toute monture rétines. Ouvrez le fichier TIF en utilisant le logiciel ImageJ puis tracer une ligne droite correspondant à la barre d'échelle. Aller à la ANALYSER, SET SCALE et entrez la distance connue et l'unité de longueur, puis cliquez sur OK. Maintenant les résultats de mesure peuvent être présentés dans des unités étalonnées, comme millimètres.
- Sélectionnez la zone d'intérêt en utilisant l'outil de sélection rectangulaire. Le pic de fluorescence doit être placé à la bordure gauche de votre sélection. Assurez-vous qu'il n'ya pas de signal de fluorescence près de la frontière droite. Si non, faire pivoter l'image active (IMAGE, puis tourner).
- CliquezAnalyser et diagramme des profils. Vous devriez voir une courbe avec une décroissance exponentielle de la gauche vers la droite.
- Cliquez sur Copier dans la fenêtre pop-up et le coller dans EXCEL. Maintenant, vous voyez deux colonnes indiquant la distance de la coupe (colonne de gauche) et l'intensité de fluorescence en fonction de la distance de la coupe (colonne de droite).
- Diviser chaque valeur brute de fluorescence par la valeur maximale de fluorescence pour obtenir l'intensité relative de fluorescence.
- Copiez deux colonnes correspondant à la distance de la coupe (X) et l'intensité de fluorescence relative (Y), puis les coller dans le logiciel Origin.
- Fit avec la décroissance exponentielle # 1 fonction (fig. 2D et figure 4D.), Qui est de la forme:
Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ)
où Y est l'intensité relative de fluorescence, Y o est la fluorescence de fond, Y max est la fluorescence maximale relative, λ est le spACE (longueur) et constante, et x est la distance de la coupe. - Comparez la constante d'espace (λ) des valeurs à différentes conditions expérimentales en utilisant le test t ou analyse de variance (fig. 2E et Fig. 4E). Notez que les techniques alternatives de quantification ont été décrits par d'autres 13,14.
4. Les résultats représentatifs
Des exemples représentatifs de traceur de cellules photoréceptrices de couplage tel que déterminé par la coupe de chargement sont présentés dans les figures 2 et 3 (poissons) et la figure 4 (le lapin). Images confocale ont été prises avec les mêmes réglages pour la comparaison (Fig. 2A-C et fig. 4A-C) et l'intensité de fluorescence a été tracée en fonction de la distance entre le coupé et monté par la fonction exponentielle montré au n ° 3.8 ci-dessus (Fig. 2D et Fig. 4D). Des valeurs constantes de l'espace pour chaque conditionsont présentés aux figures 2E et 4E, ce qui montre que l'ampleur de la jonction lacunaire traceur couplage peut être quantifiée en utilisant la technique du cut-chargement. En outre, les résultats sont hautement reproductibles. L'utilisation de la technique du cut-chargement comme un moyen de quantifier l'ampleur de la jonction lacunaire traceur couplage est également validé par la constatation que l'intensité de fluorescence décroît exponentiellement en fonction de la distance de la coupe dans tous les cas examinés 7,8 (voir aussi fig. 2D et 4D ici), ce qui indique que les photorécepteurs neurobiotin entrés via la coupe au rasoir et non à partir d'autres sites de la rétine. Par ailleurs, l'qualitativement similaire jour / nuit de différence dans le couplage des photorécepteurs traceur cellulaire observée chez les poissons rouges avec des injections traçantes en cônes unique et avec une coupe de chargement 7 corrobore coupe de chargement comme un moyen relativement précise de mesurer l'étendue du couplage des photorécepteurs.
La coupe-Ltechnique de oading peuvent également être utilisées pour étudier d'autres types de synapses électriques dans la rétine. Par exemple, la figure 5 montre que le lapin de type A (figure 5A) et de type B (Fig. 5B), les cellules horizontales présentent homologues traceur couplage suivante coupe le chargement et la diffusion de neurobiotin adaptés à l'obscurité sous conditions.
| Composé | Poissons | Souris | Lapin |
| NaCl | 130 | 120 | 117 |
| NaHCO 3 | 20 | 25 | 30 |
| NaH 2 PO 4 | - | 1 | 0.5 |
| KCL | 2.5 | 5 | 3.1 |
| Le glucose | 10 | 10 | 10 |
| MgCl 2 | 1 | - | - |
| MgSO 4 7H 2 O- | - | 1 | 1.2 |
| La glutamine | - | 0.1 | 0.1 |
| CaCl 2 | 0.7 | 2 | 2 |
Tableau 1: Composition des solutions de la Ringer pour les poissons rouges, la souris et le lapin rétines. Les concentrations sont présentés en mM. Les solutions de Ringer sont buller avec 5% de CO 2 / 95% O 2 et maintenue à 22 ° C (poissons) ou 36 ° C (mammifères). "-": Pas inclus dans le Ringer pour cette espèce.
Figure 1:. Organigramme montrant la procédure limite de chargement. Après isolement of la rétine neurale intactes, plusieurs coupures radiales ont été faites par une lame qui a été trempé dans une solution neurobiotin 0,5%. La rétine a été incubé pendant le chargement traceurs et de diffusion, puis lavés avant la fixation au paraformaldéhyde 4% (PFA) en tampon phosphate 0,1 M (PB). Tracer couplage a été examiné en utilisant la streptavidine conjuguée à Alexa-488.
Figure 2. Jour-nuit différence de photorécepteur traceur couplage dans le poisson rouge est révélée par la technique du cut-chargement. Photorécepteur écart de jonction neurobiotin traceur couplage a été étendue à la nuit (B) et dans les jours suivant l'application de spipérone (10 M), un antagoniste sélectif de dopamine D receptor 2 (C), mais pas dans la journée dans des conditions de contrôle (A). D) normalisé intensité relative fluorescentes en fonction de la distance entre les coupes (indiquées par des flèches en AC). Val espace E) constantUES obtenue à partir des données des expériences D et d'autres (n = 4). *** P <0,001.
Figure 3. Un exemple représentatif montrant la fluorescence dans la couche de cellules photoréceptrices de la rétine, adaptés à l'obscurité, la nuit suivante goldfish coupé de chargement avec une solution de deux neurobiotin et la rhodamine dextrane. Rhodamine dextrane (en rouge), qui ne diffuse pas à travers l'ouverture de canaux de jonction écart en raison de son poids moléculaire élevé (> 10 000 MW), seules les cellules étiquetées près de la coupe. En revanche, neurobiotin (représenté en vert) diffusé à travers les jonctions communicantes et peuvent être vus dans les cellules photoréceptrices loin de la coupe. L'emplacement de la coupe est indiquée par la flèche dans chaque panneau. Barre d'échelle: 200 um.
Figure 4. Jour-nuit diffèrentrence dans les photorécepteurs de la rétine de couplage traceur lapin est révélée par la technique du cut-chargement. Photorécepteur écart de jonction neurobiotin traceur couplage a été étendue à la nuit (B) et dans les jours suivant l'application de spipérone (10 uM) (C), mais pas dans la journée dans des conditions de contrôle (A). En courant alternatif, les vues perpendiculaires de la reconstruction 3D des photorécepteurs de lapin près de la coupe sont représentés. D) normalisé intensité relative fluorescentes en fonction de la distance entre les coupes. E) Les valeurs de l'espace constante obtenue à partir des données dans des expériences de développement et d'autres (n = 3). *** P <0,001.
Figure 5. Couper le chargement révèle que adaptés à l'obscurité des cellules de lapin sont horizontaux traceurs couplés. Les deux de type A (A) et de type B (B) des cellules horizontales adaptés à l'obscurité rétines de lapin exposées homologues neurobiotin traceur accouplement.
Discussion
La méthode de coupe de chargement décrite ici est une technique utile et simple pour déterminer l'étendue de couplage traceur fossé jonction entre les neurones rétiniens dans des conditions d'illumination différentes et à différents moments de la journée et la nuit. Avantages de cette technique incluent la possibilité de quantifier l'ampleur du couplage traceur écart de jonction entre les neurones dans le tissu rétinien intactes sous une variété de conditions d'éclairage pendant le jour et la nuit et de le faire pour les neurones qui ont couplé soma petit diamètre. Limites de la technique dans l'étude des jonctions gap à l'automne des tissus intacts dans deux catégories générales. Premièrement, la diffusion traceur à travers les jonctions ouvertes peuvent être relativement difficiles à observer à cause de a) le faible diamètre de la charge ou associés à des canaux ouverts et b) les volumes relatifs des compartiments cellulaires couplées 1,14,15. Autrement dit, la diffusion du traceur dans une petite cellule à une plus grande cellule ou un groupe de cellules couplées, compARED à la diffusion de traceurs d'une cellule plus grande à une petite cellule, peut-être plus difficile à détecter en raison de la dilution du traceur. Deuxièmement, dans certaines conditions physiologiques, l'étendue de la diffusion de traceur à travers des jonctions communicantes dans les tissus intacts peut ne pas refléter avec précision la force de la conductance jonctions lacunaires en raison de différences dans la conductance des petits porteurs de courant électrique d'ions, par rapport à la perméabilité de traceur relativement importante molécules 1,14,15. En général, les preuves de traceur couplage suggère fortement la présence de fonctionnement, ouvrir des canaux de jonction lacunaire, mais sous certaines conditions physiologiques, la diffusion traceur peut pas se produire ou être observée même si les enregistrements électrophysiologiques suggèrent la présence de fonctionnement, les jonctions ouvertes.
Il semble probable que la technique du cut-chargement peut également être utilisé pour étudier l'ampleur du couplage traceur écart de jonction entre les neurones dans le tissu intact depuis d'autres régions du système nerveux centralTEM.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le NIH aux subventions EY005102 SCM et EY018640 à CPR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
| Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
| Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman, GE Healthcare | 1004-090 | |
| Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP-1120 | 0.5% |
| Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
| Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ImageJ Software | National Institutes of Health | ||
| OriginPro 8.0 | OriginLab |
References
- Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain. Neuron. 41, 495-511 (2004).
- Connors, B. W., Long, M. A.
- Vaney, D. I. Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin. Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).
- Bloomfield, S. A., Völgyi, B. The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina. Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).
- Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).
- Xin, D., Bloomfield, S. A. Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).
- Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling. Neuron. 59, 790-801 (2008).
- Ribelayga, C., Mangel, S. C. Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina. PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).
- Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway. Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).
- Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP. Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).
- Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes. Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).
- Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina. J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).
- Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina. J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).
- Mills, S. L., Massey, S. C. The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina. Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).
- Mills, S. L., Massey, S. C. A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina. J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).
