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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Mauspositionierung
1. Beurteilen Sie den Grad der Anästhesie durch Pedalreflex (festes Einklemmen der Zehen), um die chirurgische Ebene zu erhalten.
2. Platzieren Sie das Positionierungsgerät in einem angemessenen Abstand und einer angemessenen Höhe, um einen bequemen Zugang zu allen benötigten Reagenzien zu ermöglichen.
3. Sobald die Mäuse richtig betäubt sind, heben Sie jede Maus vorsichtig mit Daumen und Zeigefinger am Nacken an und legen Sie sie auf den dafür vorgesehenen Stuhl.
4. Die richtige Positionierung der Maus auf dem Stuhl ist in dieser Phase sehr wichtig. Legen Sie den Rücken der Maus parallel zur Rückenlehne des Stuhls und im 90°-Winkel zum Stuhlsitz. Heben Sie die Hände von der Maus und lassen Sie das Tier natürlich in der Kopf-auf-und-Vorwärts-Position liegen, ohne zu drücken oder zu drücken, wie in Abbildung 1B gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Vorderbeine der Maus eine natürliche Unterstützung bieten, während sich das Tier in dieser entspannten Position befindet, ohne dass die Maus sich unwohl fühlt.
5. Sobald die Mäuse richtig positioniert sind, schnallen Sie die Mäuse mit dem Stuhlgurt an und beginnen Sie sofort mit der intranasalen Inokulation.
2. Intranasale (IN) Verabreichung
HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die IN-Verabreichung von RVG9R:siRNA-Komplexen mit dem Mauspositionierungsgerät. Mit diesem Protokoll können jeder Maus problemlos maximal 20-30 μl Lösung in 2 μl Tropfen verabreicht werden. Dieses Volumen ist geringer als das der Nasenhöhle der Maus, die 0,032 cm3 beträgt, so dass der Eingriff nicht zu einer tödlichen Obstruktion des Nasenlochs oder Erstickung führt. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Inokulation von mindestens vier Mäusen und maximal acht Mäusen pro Gerät, was zu einer Zeitoptimierung und einer reduzierten Variabilität führt.
1. Nimm die 10 μL Mikropipette und stelle sie auf 2 μL ein.
2. Laden Sie die Mikropipette mit 2 μl RVG9R:siRNA-Komplexlösung (z. B. 5,2 μg siCy5 komplexiert mit 104 μg RVG9R für das Verabreichungsexperiment und 13,5 μg siSOD1 komplexiert mit 270 μg RVG9R für das Silencing-Experiment, in ein Endvolumen von 25 μl PBS mit 5% Glukose).
3. Während du die Pipette in der dominanten Hand hältst, passe die Position an, indem du einen Ellbogen auf die Tischplatte legst. Stützen Sie die Hand, die die Pipette hält, mit der anderen Hand ab, um unkontrollierte Bewegungen während der Verabreichung zu vermeiden.
4. Platzieren Sie einen ~2 μL Tropfen sehr nahe an einem Nasenloch, damit die Maus das Tröpfchen direkt einatmen kann (siehe Abbildung 1B). Wenn sich ein winziger Tropfen nicht leicht bilden lässt, ersetzen Sie die Pipettenspitze durch eine neue und wiederholen Sie den Vorgang. Verwenden Sie die Stoppuhr, um das Zeitintervall zwischen den Impfungen zu überprüfen.
5. Dieses Gerät ermöglicht die Behandlung von mindestens vier Mäusen gleichzeitig. Wenn eine andere Gruppe von Mäusen erforderlich ist, um Schritt 2.4 zu wiederholen, stellen Sie eine weitere Stange mit vier Stühlen über oder unter der ersten Stange mit vier Stühlen auf, um bis zu acht Mäuse gleichzeitig auf dem Gerät unterzubringen.
6. Wiederholen Sie Schritt 2.4 mit dem anderen Nasenloch nach 3-4 Minuten nach der ersten Inokulation. Dieses Zeitintervall reicht aus, damit die Maus die Inhalation der ersten Dosis abschließen und die normale Atmung wiederherstellen kann. Wenn sich ein Tropfen der inhalierten Lösung durch versehentliches Schnauben aus der Naris der Maus löst, inokulieren Sie weitere 2 μl der Lösung.
7. Wiederholen Sie den gesamten Vorgang mit abwechselnden Nasenlöchern, bis die Dosis von 20-30 μL beendet ist. Es dauert ~30-45 Minuten, bis der gesamte Impfvorgang abgeschlossen ist.
8. Tragen Sie feuchte Salbe auf die Augen der Mäuse auf, bevor Sie die Mäuse in ihre vorgesehenen Käfige zurückbringen.
HINWEIS: Lassen Sie die Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt haben, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten.
