In-vivo-Bildgebung von Neuronenantworten genikulater Ganglien mittels Epifluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Fowler, B. E., et al. In vivo Calcium-Bildgebung von Neuronen genikulater Ganglienneuronen von Mäusen auf Geschmacksreize. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Verabreichung von Schmackstoffen an das chirurgisch exponierte Genikulatganglion in einer anästhesierten Maus und die Verwendung von GCaMP-Fluoreszenz mit Epifluoreszenzmikroskopie, um neuronale Reaktionen in Echtzeit zu visualisieren und Studien zur peripheren Geschmackssignalverarbeitung zu unterstützen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Führen Sie tastant panel
   1. Verwenden Sie den Sog, um Flüssigkeit über dem Genikulat zu entfernen. Platzieren Sie optional einen Absorptionspunkt, um das Durchsickern zu verringern und die Mikroskopnavigation zu erleichtern.
   2. Legen Sie das Tier auf ein saugfähiges Pad unter das Mikroskop. Lokalisieren Sie das Ganglion geniculatus: Nützliche Orientierungspunkte sind das Loch in der Bulla, das Loch im Schläfenbein und der siebte Nerv. Prüfen Sie mit dem FITC/GFP-Filter (Fluorescein Isothiocyanate/ grün fluoreszierendes Protein) am Epifluoreszenzskop auf einzelne GCaMP-exprimierende Genikulatganglienneuronen. Ein 10-fach-Objektiv (Arbeitsabstand von 10 mm) bietet eine ausreichende Auflösung, um die Aktivität einzelner Zellen zu verfolgen, aber auch ein 20-fach-Objektiv (Arbeitsabstand von 12 mm) kann verwendet werden.
   3. Platzieren Sie die Dosiernadel für den Geschmacksfaden fest im Maul des Tieres. Platzieren Sie eine Petrischale unter dem Maul des Tieres, um Flüssigkeit aufzufangen.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Kamera das Sichtfeld des Mikroskops betrachtet. Synchronisieren Sie den Start der Videoaufzeichnung mit dem Start der geschmackvollen Präsentation.
   5. Beobachten Sie während der Aufzeichnung den Live-Feed auf Antworten, Drift und Sicker.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1ml Spritze mit Luer-Lock	Fisher Scientific	14-823-30
27 Gauge stumpfe Dosiernadel	Fisher Scientific	NC1372532
Absorptionspunkte	Fisher Scientific	50-930-668
Acesulfam K	Fisher Scientific	A149025G
BD Allergologen Tabletts mit fest angebrachter Nadel	Fisher Scientific	14-829-6D
Blunt Retractors	FST	18200-09
Breadboard	Thor Labs	MB8
Custom Head Post Holder	eMachineShop		Siehe angehängte Datei 202410.ems
Custom Metal Head Post	eMachineShop		Siehe angehängte Datei 202406.ems
DC Temperaturregler	FHC	40-90-8D
Digitalkamera, sCMOS OrcaFlash4 Mikroskop montiert	Hamamatsu	C13440
Disektionsskop	Leica	M80
LED Kaltlichtquelle	Leica Mcrosystems	KL300LED
Luer-Lock 1/16" Schlauchadapter	Fisher	01-000-116
Mikroskop	Olympus	BX51WI
Mini-Serie Optische Stifte	Thorlabs	MS2R
Petrischalen	Fisher Scientific	FB0875713A
Druckluft	Airgas	AI Z300
Selbstklebende Beschriftung Klebeband	Fisher Scientific	159015R
Silikon-Quetschventilschlauch 1/32" x 1/16" Außendurchmesser (pro Fuß)	Automate Scientific	05-14
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	25111
Student Feine Schere	Fine Science Tools	91460-11
Chirurgische Sonde	Roboz Surgical Store	RS-6067
Chirurgischer Sondenhalter	Roboz Surgical Store	RS-6061
BD Intramedic Schlauch	Fisher Scientific	22-046941
Zweistufiger Gasregler	Airgas	Y12FM244B580-AG
Tygon Vinylschlauch - 1/16"	Automate Scientific	05-11
Valvelink8.2 digitaler/manueller Controller	Automatisieren Scientific	01-18
Valvelink8.2 Quetschventil-Perfusionssystem	Automatisieren Sie Scientific	17-pp-54
Xylazin	Anased	NADA# 139-236