Bildgebung der Freisetzung von Neurotransmittern mit zellbasierten Neurotransmitter-Fluoreszenz-Reportern

Zusammenfassung

Quelle: Lacin, E., et al. Konstruktion von zellbasierten Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reportern (CNiFERs) für die optische Detektion von Neurotransmittern in vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt eine Technik zur Abbildung der Neurotransmitterfreisetzung in vivo unter Verwendung von zellbasierten Neurotransmitter-Fluoreszenz-Reportern (CNiFERs), spezialisierten Reporterzellen, die in die Hirnrinde der Maus vorinjiziert werden. Die Maus wird unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop positioniert und ermöglicht die Visualisierung der Neurotransmitter-induzierten Kalziumsignalisierung durch Fluoreszenzemission. Die Methode nutzt die Bindung von Neurotransmittern an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf CNiFERs und löst die Freisetzung von Kalzium und die Fluoreszenz aus, um die Aktivität von Neurotransmittern in Echtzeit zu erkennen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. CNiFER-Implantation in den Mauskortex

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Operation in einem Autoklaven. Bereiten Sie ein halbsteriles Feld für die Operation vor, indem Sie es mit 70 % Ethanol abwischen und eine saubere Laborwindel auflegen.
2. Bereiten Sie die CNiFER-Injektionspipette vor, indem Sie eine Glaskapillare (Innendurchmesser von 0,53 mm) an einem vertikalen Elektrodenabzieher ziehen. Verwenden Sie eine Pinzette Nr. 5 mit feiner Spitze, um die Spitze der Elektrode auf einen Durchmesser von ~40 μm zu brechen.
   Hinweis: Dies geschieht am besten unter einem Stereo-Zoom-Mikroskop mit einem Raster.
3. Anästhesie einer erwachsenen C57BL/6-Maus (postnataler Tag 60-90) mit Isofluran: 4 % (v/v) zur Induktion und 1,5 bis 2,0 % (v/v) zur Erhaltung. Verwenden Sie eine Schwanz- oder Zehenkneife, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist.
   Hinweis: Kneifen Sie regelmäßig erneut und beurteilen Sie das Zucken der Schnurrhaare während der Operation, um die Narkosetiefe neu zu beurteilen.
4. Bedecken Sie die Augen mit Augensalbe, um ein Austrocknen zu verhindern. Montieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen mit Ohrbügeln. Halten Sie die Körpertemperatur der Maus auf 37 °C mit einem Wärmekissen, das von einer Rektalsonde reguliert wird.
5. Rasieren Sie eine Fläche von ca. 5 mm x 12 mm mit einem Elektrorasierer für Tiere. Tragen Sie Betadin gefolgt von 70% (v/v) Isopropanol auf. Verwende eine Skalpellklinge, um die Haut über der Schädeloberfläche zu schneiden und zu entfernen. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um das Periost von der Schädeloberfläche zu entfernen. Legen Sie die Oberfläche des Schädels frei und reinigen Sie sie, wie bei der stereotaktischen Chirurgie beschrieben.
6. Senken Sie eine leere Glaspipette auf das Bregma und notieren Sie die antero-posterioren (A/P) und mediolateralen (M/L) Koordinaten. Berechnen Sie anhand des Atlas des Mausgehirns die Position der Injektionsstelle. Verschieben Sie die Pipette an die Zielstelle und markieren Sie den Schädel für die spätere Fensterbildung.
   Hinweis: Die Injektionsstelle und das Fenster hängen von der zu untersuchenden Region und der Verteilung der Neurotransmitter- oder Peptidfreisetzungsprojektionen im Kortex ab. In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung wurden beispielsweise die stereotaktischen Koordinaten +1,0 bis +2,0 mm A/P und +1,0 bis +2,0 mm M/L verwendet, um CNiFER-Zellen in den frontalen Kortex zu injizieren, um in vivo die Dopaminfreisetzung während der klassischen Konditionierung abzubilden.
7. Bilden Sie ein 2 mm x 3 mm dünnes Schädelfenster.
   Hinweis: Der Knochen im Fenster sollte 15-20 μm dick sein. Die kleinen weißen Flecken im Knochen sollten bei einer Befeuchtung der Schädeloberfläche nicht sichtbar sein, wenn der Knochen ausreichend ausgedünnt ist.
8. Legen Sie einen mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) getränkten Schwamm auf das Fenster, um es feucht zu halten, während Sie die Zellen für die Injektion vorbereiten.
9. Ernte den CNiFER-Klon, der in einem T75-Kolben gezüchtet wurde, auf ~80% Konfluenz. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Hinweis: Trypsin wird bei diesen Schritten weggelassen.
10. PBS wird entfernt und 10 ml ACSF verwendet, um Zellen vom Boden des Kolbens zu entfernen. Zerreiben Sie Zellen, um Zellklumpen zu dissoziieren. Das Pellet wird in 100 μl ACSF zentrifugiert und resuspendiert. 30 Sekunden lang bei 1.400 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen, wobei ein Pellet mit ACSF bedeckt bleibt. Dieser Schritt hinterlässt einen Zellklumpen in Suspension.
11. Füllen Sie die in Schritt 1.2 vorbereitete Injektionspipette mit Mineralöl auf, laden Sie die Pipette auf einen Nanoinjektor und schieben Sie den Kolben vor, um eine kleine Ölperle auszustoßen. Geben Sie 5 μl CNiFER-Zellsuspension auf einen Streifen Paraffinfolie in der Nähe der Mausvorbereitung. Ziehen Sie entweder die CNiFERs oder kontrollieren Sie die CNiFER-Zellen in die gezogene Pipette.
12. Bewegen Sie die Pipette auf die X- und Y-Zielkoordinaten, d.h. A/P und M/L, die in Schritt 1.5 notiert wurden. Senken Sie die Pipette ab, stechen Sie in den ausgedünnten Schädel und fahren Sie mit ~200-400 μm unter der Schädeloberfläche fort, um CNiFER-Zellen in den Schichten 2/3 des Kortex zu deponieren.
13. Injizieren Sie ~4,6 nl CNiFER-Zellen an der tiefsten Stelle mit dem Nanoinjektor, notieren Sie die Bewegung in der Öl- und Zellschnittstelle und warten Sie dann 5 Minuten, bis die Zellen ausgegeben sind. Ziehen Sie die Pipette ~100 μm zurück und injizieren Sie weitere ~4,6 nl CNiFER-Zellen, warten Sie 5 Minuten. Ziehen Sie dann die Pipette langsam und vorsichtig zurück, um einen Rückfluss der CNiFERs zu verhindern. Wiederholen Sie die Injektionen an einer oder mehreren benachbarten Stellen.
14. Wiederholen Sie die Injektionsschritte 1.8-1.12 mit Kontroll-HEK293-Zellen (d. h. HEK293/TN-XXL/Gqi5-Klon ohne G-Protein-gekoppelten Rezeptor [GPCR]). Trennen Sie die Injektionsstellen der CNiFER und der Kontrollzelle um ~200 μm.
15. Spülen Sie nach Abschluss der Zellimplantation das Fenster des verdünnten Schädels mit ACSF und warten Sie, bis der Schädel getrocknet ist. Tragen Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber (siehe Materialien) auf das Fenster auf und legen Sie schnell ein vorgestanztes steriles Deckglas auf den Kleber. Drücke das Deckglas einige Sekunden lang vorsichtig gegen den Schädel. Lassen Sie den Kleber 2 min trocknen.
16. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Zahnzement und formen Sie eine Vertiefung um das Fenster, um Wasser für das Tauchobjektiv aufzunehmen.
17. Um den Kopf der Maus während der Bildgebung ruhig zu stellen, befestigen Sie eine speziell angefertigte Kopfstange mit einem kleinen Tropfen Cyanacrylatkleber hinter dem Fenster. Lassen Sie den Kleber gründlich trocknen und fügen Sie dann zusätzlichen Zahnzement hinzu, um die speziell angefertigte Kopfstange weiter zu verstärken.
18. Bedecken Sie den Rest der Schädeloberfläche, mit Ausnahme des Fensters, mit einer Schicht Zahnzement. Stellen Sie sicher, dass die Ränder der Haut mit Zement bedeckt sind und lassen Sie ihn 20 Minuten trocknen.
19. Beenden Sie nach der Operation die Verabreichung von Isofluran und lassen Sie die Maus auf einem Heizkissen in einem Käfig, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat. Injizieren Sie 5 % (w/v) Glukose in Kochsalzlösung (subkutan [s.c.]) zur Rehydratation und 0,05 bis 0,1 mg/kg Buprenorphin (intraperitoneal [i.p.], sofortige Freisetzung) zur postoperativen Analgesie.
    Hinweis: Um eine mögliche immunologische Reaktion auf die humanen CNiFERs zu minimieren, injizieren Sie der Maus täglich 20 μl/100 g Cyclosporin (i.p.), beginnend am Tag vor der Injektion von CNiFERs.
20. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück, um Futter und Wasser zu erhalten.

2. In-vivo-Bildgebung von CNiFER-Klonen

Hinweis: Die Live-Bildgebung wird mit Mäusen unter Verwendung eines Zwei-Photonen-Mikroskops und eines am Kopf befestigten Geräts durchgeführt. Während der bildgebenden Verfahren ist keine Anästhesie erforderlich. Wenn Sie sich Tiere im wachen Zustand vorstellen, beschränken Sie die Kopfstütze auf jeweils nur wenige Stunden, um den Stresspegel zu reduzieren. Bringen Sie das Tier zwischen den Bildgebungssitzungen in seinen Käfig zurück, um Futter und Wasser zu erhalten. Mögliche Belastungen werden minimiert, indem die Raumbeleuchtung abgedunkelt und ein Teil der Maus in einem Gehäuse umschlossen wird.

1. Montieren Sie die Maus am Tag nach der Operation auf einer Bildgebungsplattform, indem Sie die am Schädel implantierte Metallkopfstange mit dem Rahmen für die Kopffixierung verschrauben.
   Hinweis: Bei der Bildgebung von wachen Mäusen sollte die Bildgebungssitzung aufgrund der potenziellen Belastung, die durch die Kopfstütze verursacht wird, nicht länger als einige Stunden dauern.
2. Platzieren Sie die Bildgebungsplattform mit der kopfgestützten Maus in einem Zwei-Photonen-Bildgebungsmikroskop, das mit einem 10-fachen (0,30 NA) und 40-fachen (0,80 NA) Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist.
3. Einsetzen eines Filterwürfels für die Fluoreszenzresonanz-Energietransfer-Bildgebung (FRET) (Enhanced Cyan Fluorescent Protein [eCFP] und Citrin) mit einem dichroitischen Spiegel bei 505 nm und Bandpassfiltern von 460 nm bis 500 nm für die Messung von eCFP und 520 nm bis 560 nm für die Messung von Citrin.
4. Fügen Sie ACSF zu dem Brunnen hinzu, der das Fenster für den verdünnten Schädel enthält, und senken Sie das Wasserimmersionsobjektiv in das ACSF ab. Verwenden Sie das Okular in Verbindung mit einer Quecksilberlampe und einem Filterwürfel für grün fluoreszierendes Protein (GFP), um die Oberfläche der Rinde und des Gefäßsystems unter dem Fenster zu lokalisieren.
   Hinweis: Das Muster des Gefäßsystems hilft dabei, dieselbe Region über wiederholte Bildgebungstage hinweg zu lokalisieren und abzubilden. Wechseln Sie zum 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv, um CNiFERs zu lokalisieren, indem Sie mit dem GFP-Filterwürfel und einer Quecksilberlampe manuell auf die Oberfläche des Kortex über den Zellen fokussieren.
5. Eingerichtet für die Zwei-Photonen-Bildgebung. Wählen Sie den geeigneten Strahlengang für die Zwei-Photonen-Bildgebung. Bei einem typischen kommerziellen System können Sie mit der Software in den Zwei-Photonen-Bildgebungsmodus wechseln und das Licht auf die Photomultiplier-Röhren (PMTs) in den nicht degescannten Detektoren umleiten. Schalten Sie den gepulsten Femtosekundenlaser im nahen Infrarot ein, wählen Sie eine Wellenlänge von 820 nm und eine Leistungseinstellung von 5-15 %.
   Hinweis: 5 % Leistung liefern typischerweise ~25 mW an der Probe.
6. Stellen Sie die PMT1- und PMT2-Spannung nahe dem Maximalwert ein, typischerweise 700-1.000 V je nach PMT. Stellen Sie die Verstärkung für jeden Kanal auf 1 ein und stellen Sie die z-Position für das Objektiv auf Null
.
7. Senken Sie das Objektiv ~100 bis 200 μm von der kortikalen Oberfläche ab und starten Sie den x-y-Scan. Passen Sie die Laserleistung, die Verstärkung und die PMT-Spannung für jeden Kanal an, d. h. eCFP und Citrin, um das Signal-Rausch-Verhältnis der CNiFER-Fluoreszenz zu optimieren.
8. Verwenden Sie die Zoomfunktion in der Software, um das Bild auf einen Bereich zu beschränken, der die CNiFER-Zellen sowie einen Hintergrundbereich enthält. Verwenden Sie eine Scanrate, die nicht langsamer als ein Bild alle 2 Sekunden (0,5 Hz) bei 4 μs pro Pixel ist. Passen Sie die Zeilenmittelung für ein geeignetes Signal-Rausch-Verhältnis an, z. B. Kalman 2-Zeilen-Mittelwertbildung.
9. Zeichnen Sie einen Region-of-Interest (ROI) um CNiFER-Zellen, der etwa 3 bis 4 Zellen pro Ebene umgibt. Richten Sie eine Echtzeitanalyse der durchschnittlichen ROI-Intensitäten ein. Starten Sie die Erfassung, um die CNiFER-Fluoreszenz über die Zeit zu überwachen.
10. Sammeln Sie Fluoreszenz von CNiFERs vor und während experimenteller Manipulationen, z. B. elektrische Stimulation, Channelrhodopsin-2 (ChR2)-Stimulation, Verhalten, wie vom Benutzer bestimmt.
11. Wenn das Bildgebungsexperiment abgeschlossen ist, bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück. Wiederholen Sie die Bildgebung wie gewünscht über mehrere Tage. Bei der erneuten Bildgebung beziehen sich die Zellen auf das zuvor aufgenommene Gefäßbild mit geringer Vergrößerung, um sich wieder auf das gleiche Bildfeld zu orientieren (Schritt 2.4).
    Hinweis: Implantierte CNiFERs können mindestens 7 Tage lang abgebildet werden.

Materialien