Isolierung und Reinigung von rekombinanten Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen

Zusammenfassung

Quelle: Jain, R. W., et al. Einfache und effiziente Herstellung und Aufreinigung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein aus der Maus für experimentelle Studien zur Autoimmun-Enzephalomyelitis. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Isolierung und Reinigung von MOGtag, einem rekombinanten Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG), das in experimentellen Studien zur Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) verwendet wird. Das Protokoll umfasst bakterielle Lyse, Beschallung, Zentrifugation und Nickelaffinitätschromatographie, um gereinigten MOGtag zu erhalten. Dieses Protein ermöglicht die B-Zell-vermittelte Autoimmunforschung in Modellen der Multiplen Sklerose.

Protokoll

1. Urheberrecht Ernte des MOGtag-Proteins

HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt haben die Bakterien große Mengen an MOGtag-Protein produziert. Um MOGtag zu gewinnen, werden die Bakterien zunächst in einem Triton X-100-Puffer lysiert, gefolgt von einer Beschallung. MOGtag wird dann aus Einschlusskörpern freigesetzt und mit Imidazol und Guanidin denaturiert, was zu einer Rohproteinlösung führt, die das MOGtag-Protein enthält.

1. Entnehmen Sie ein 1 ml Aliquot aus einer der Übernachtkulturen und überführen Sie es in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen bei 16.000 x g für 1 min und entfernen Sie den Überstand. Beschriften Sie das Röhrchen mit TO/N (nach der Induktion) und legen Sie das Bakterienpellet dann für die zukünftige SDS-Seitenanalyse in einen -20 °C-Gefrierschrank (Abbildung 2).
2. Verteilen Sie die Kulturen gleichmäßig auf 250-ml-Flaschen, die mit der Hochgeschwindigkeitszentrifugation kompatibel sind, und halten Sie diese von diesem Zeitpunkt an auf Eis. Pelletieren Sie die Bakterienzellen bei 22.000 x g für 15 min bei 4 °C.
3. Entsorgen Sie den Überstand. Lagern Sie die Bakterienpellets bei -20 °C oder fahren Sie mit Schritt 1.4 fort.
4. Bereiten Sie den Lysepuffer (0,1 mg/ml Hühnerei-Lysozym, 0,1 % Triton-X (v/v) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)) vor, indem Sie 60 μl Triton X-100 und 120 μl 50 mg/ml Hühnerei-Lysozym-Stammlösung zu 60 ml PBS hinzufügen.
5. Resuspendieren und kombinieren Sie alle Bakterienpellets aus Schritt 1.3 in insgesamt 30 ml Lysepuffer. Übertragen Sie dieses Volumen in ein 50-ml-Röhrchen mit rundem Boden, das für eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation geeignet ist. Legen Sie diesen Schlauch für 30 min in ein 30 °C heißes Wasserbad. Schütteln Sie das Röhrchen während der Inkubationszeit zweimal, um die Zellen wieder zu suspendieren.
6. Übertragen Sie nach der Inkubation das Röhrchen auf das Eis und beschallen Sie die Lösung bei 20 kHz, Amplitude 70%, Impuls an für 3 Sekunden, Impuls aus für 3 Sekunden und fünf Impulse pro Runde. Beschallen Sie die Lösung für insgesamt sechs Runden und lassen Sie die Lösung zwischen den Runden auf Eis abkühlen.
7. Die Lösung bei 24.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Schritte 1,5-1,7 einmal wiederholen. Lagern Sie das Pellet bei -20 °C oder fahren Sie mit Schritt 1.8 fort.
8. Puffer A (500 mM NaCl (Natriumchlorid), 20 mM Tris-HCl (Tris (Hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid), 5 mM Imidazol, pH 7,9) wird durch Zugabe von 0,8766 g NaCl, 0,09456 g Tris-HCl und 0,01021 g Imidazol in ein 100-ml-Becherglas vorbereitet. Fügen Sie Wasser hinzu, bis das Volumen 28 ml erreicht, und stellen Sie dann den pH-Wert der Lösung auf 7,9 ein. Füllen Sie dann die Lösung in einen 100-ml-Messzylinder und fügen Sie Wasser hinzu, bis das Volumen 30 ml beträgt.
9. Das Pellet aus Schritt 1.7 wird in 30 ml Puffer A resuspendiert und diese Lösung 3 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Wiegen Sie in dieser Zeit 17,2 g Guanidin-HCl ab.
10. Beschallen Sie die Lösung auf Eis mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 1.6. Geben Sie dann 17,2 g Guanidin-HCl in die Lösung. Inkubieren Sie dies 1 Stunde lang auf Eis, um das MOGtag-Protein zu lösen.
11. Die Lösung wird bei 24.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird aufgefangen und der Überstand wird bis zur Proteinreinigung bei 4 ΰC gelagert.

2. Proteinreinigung

HINWEIS: In den folgenden Schritten wird das MOGtag-Protein durch 4 Absorptionsrunden auf geladenes Nickelharz (über den His-Tag) und Elution gereinigt.

1. Stellen Sie die folgenden Puffer her:
   1. Bereiten Sie Puffer B vor (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM Imidazol, 6 M Guanidin-HCl, pH 7,9). 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 0,0681 g Imidazol und 114,64 g Guanidin-HCl in ein 500-ml-Becherglas geben. Fügen Sie dann Wasser hinzu, bis es 190 ml erreicht, und stellen Sie den pH-Wert auf 7,9 ein. Füllen Sie die Lösung in einen 250-ml-Messzylinder und fügen Sie Wasser hinzu, bis das Volumen 200 ml beträgt.
   2. Bereiten Sie den Elutionspuffer vor (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M Imidazol, 6 M Guanidin-HCl, pH 7,9). 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 6,808 g Imidazol und 114,64 g Guanidin-HCl in ein 500-ml-Becherglas geben. Fügen Sie Wasser hinzu, bis es 190 ml erreicht, und stellen Sie den pH-Wert auf 7,9 ein. Füllen Sie die Lösung in einen 250-ml-Messzylinder und fügen Sie Wasser hinzu, bis das Volumen 200 ml beträgt.
   3. Bereiten Sie den Streifenpuffer vor (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), pH 7,9). 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA in ein 500 ml-Becherglas geben. Fügen Sie Wasser hinzu, bis es 190 ml erreicht, und stellen Sie den pH-Wert auf 7,9 ein. Füllen Sie die Lösung in einen 250-ml-Messzylinder und fügen Sie Wasser hinzu, bis das Volumen 200 ml beträgt.
   4. Bereiten Sie den Ladungspuffer (0,1 M Nickelsulfat) vor. Geben Sie 5.257 g Nickelsulfat in ein 500-ml-Becherglas und fügen Sie Wasser hinzu, bis es 190 ml erreicht (ACHTUNG, fassen Sie Nickelsulfat nicht außerhalb eines Abzugs an, bis das Nickelsulfat in Wasser gelöst wurde). Sobald sich das Nickelsulfat aufgelöst hat, wird die Lösung in einen 250-ml-Messzylinder umgefüllt und Wasser hinzugefügt, bis das Volumen 200 ml erreicht.
2. 10 ml Nickelharz werden auf zwei konische 50-ml-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, die Zentrifugalkräften von mehr als 4.500 x g (5 ml in jedem Röhrchen) standhalten.
3. Laden Sie das Nickelharz auf und äquilibrieren Sie es:
   1. Waschen Sie das Harz, indem Sie 40 ml Wasser in jedes Röhrchen geben, das das Harz enthält. Legen Sie die Rohre waagerecht auf eine Wippe und lassen Sie sie 5 min bei 4 °C rühren. Wenn Sie fertig sind, zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4.500 x g für 8 min bei 4 °C.
   2. Entsorgen Sie den Überstand durch Pipettieren, um eine Störung des Pellets zu vermeiden. Geben Sie 40 ml Ladungspuffer in jedes Röhrchen. Schieben Sie die Röhrchen auf eine Wippe und lassen Sie sie 15 min bei 4 °C rühren. Wenn Sie fertig sind, zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4.500 x g für 8 min bei 4 °C.
   3. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie dann 40 ml Puffer B in die Röhrchen. Schieben Sie die Röhrchen auf eine Wippe und lassen Sie sie 5 min bei 4 °C rühren. Wenn Sie fertig sind, zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4.500 x g für 8 min bei 4 °C und entsorgen Sie dann die Überstände.
4. Optional: Nehmen Sie 150 μl des in Schritt 1.11 gesammelten solubilisierten Proteins und überführen Sie es in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Kennzeichnen Sie das Röhrchen als Vorinkubation und frieren Sie es bei -20 °C für die zukünftige SDS-Seitenanalyse (Natriumdodecylsulfat) ein (Abbildung 2, RohMOGtag).
5. Reinigen Sie das MOGtag-Protein:
   1. Übertragen Sie das gesamte Volumen des löslichen Proteins aus Schritt 1.11 (~40 ml, abzüglich der in Schritt 2.4 entnommenen kleinen Probe) in das erste Röhrchen (Abbildung 1, Röhrchen 1) mit Nickelharz aus Schritt 2.3, mischen Sie es und legen Sie es horizontal für 1 Stunde bei 4 °C auf eine Wippe.
   2. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 4.500 x g für 8 min bei 4 °C. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie den Überstand in das zweite Röhrchen (Abbildung 1, Röhrchen 2) mit Nickelharz und inkubieren Sie wie im vorherigen Schritt beschrieben. In der Zwischenzeit mit den Schritten 3 bis 6 unten mit Schlauch 1 fortfahren.
   3. Resuspendieren Sie das Nickelharz in einem Röhrchen 1 in 40 ml Elutionspuffer und stellen Sie das Röhrchen horizontal auf eine Wippe bei 4 °C für 5 min. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 4.500 x g für 8 min bei 4 °C.
   4. Der Überstand, der das eluierte MOGtag-Protein enthält, wird in eine 250-ml-Flasche mit der Aufschrift "gereinigtes MOGtag-Protein" umgefüllt und diese Flasche bei 4 °C gehalten. Bei jedem Elutionsschritt wird der resultierende Überstand in dieser Flasche gepoolt.
   5. Geben Sie 40 ml Streifenpuffer zum Nickelharz und legen Sie es für 5 min bei 4 °C waagerecht auf eine Wippe
   .
   6. Das Röhrchen bei 4.500 x g für 8 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen und dann das Nickelharz wie in Schritt 2.3 beschrieben wieder auffüllen.
   7. Wenn Sie fertig sind, fahren Sie mit der zweiten Röhre fort, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Insgesamt 4 Absorptionsrunden des solubilisierten Proteins aus Schritt 1.11 auf das geladene Nickelharz und die Elution werden den größten Teil des Proteins zurückgewinnen, obwohl, falls gewünscht, zusätzliches Protein in zusätzlichen Absorptions- und Elutionsrunden zurückgewonnen werden könnte.
6. Sobald vier (oder mehr) Absorptions- und Elutionsrunden abgeschlossen sind, lagern Sie das gepoolte gereinigte Protein über Nacht bei 4 °C. Nickelharz kann in 40 ml einer 20%igen Ethanollösung bei 4 °C gelagert werden, bis es wieder benötigt wird.

Ergebnisse

Abbildung 1: Überblick über die erforderlichen Schritte zur Herstellung des reinen MOGtag-Proteins. Um das MOGtag-Protein zu erzeugen, werden Bakterien, die das MOGtag-Protein exprimieren, auf hohe Dichten gezüchtet und dann ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BL21 E.coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		Diese Bakterien werden benötigt, um das MOGtag-Protein herzustellen. Glycerinbestände dieser Bakterien sind auf Anfrage erhältlich.
LB Brühe Müller	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	Bio basic	AB0028	Rekonstituiert das Pulver zu 50 % Ethanol/ 50 % H₂O bei 100 mg/ml. Bei -20 °C lagern.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Rekonstituieren Sie das Pulver bei 1M zu H₂O und lagern Sie es bei -20 °C.
Hühner-Ei-Lysozym	Bioshop	LYS702.10	Rekonstituiert in H₂O bei 50 mg/ml und lagert bei -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Life Technologies	20012-027	Kommerzielle phosphatgepufferte Kochsalzlösung ist nicht erforderlich, jede im Labor hergestellte phosphatgepufferte Standardkochsalzlösung ist ausreichend.
Natriumchlorid	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazol	Bioshop	IMD508.100
Guanidin-HCl	Sigma	G3272	Die Qualität muss mehr als 98% Reinheit betragen.
0.5M EDTA	bioshop	EDT111.500
Nickel (II)-sulfat	Bioshop	NIC700.500
His Bind Resin	EMD Millipore	69670-3	In 20 % Ethanol 80 % H₂O bei 4 °C wasserfreies
Ethanol	Kommerzielle Alkohole	P016EAAN	Bedarf mit Wasser verdünnen.
Eisessig	Bioshop	ACE222.1
Natriumacetat-Trihydrat	Bioshop	SAA305.500
Rinderserumalbumin Standard	Bio-rad	500-0206
Ethylendiamin-Tetraessigsäure, Dinatriumsalz-Dihydrat	Fisher scientific	BP120-500
Polyethylenglykol 3350	Bioshop	PEG335.1
Polyethylenglykol 8000	Bioshop	PEG800.1
Ultraschallgerät	Fisher scientific	FB-120-110
Natriumdodecylsulfat	Bioshop	SDS001

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