Regulierung des Wachstums von Schwann-Zellen in vitro mit der Nanosekunden-Technik des gepulsten elektrischen Feldes

Zusammenfassung

Quelle: Han, J., et.al. Regulierung des Wachstums von Schwann-Zellen durch gepulstes elektrisches Feld im Nanosekundenbereich für die Regeneration peripherer Nerven in vitro. J. Vis. Exp. (2024)

Dieses Video zeigt die Anwendung der Nanosekunden-Technik des gepulsten elektrischen Feldes (nsPEF) zur Modulation des Wachstums von Schwann-Zellen (SC). Die schnellen elektrischen Pulse induzieren transiente Nanoporen in SC-Membranen und erleichtern den Kalziumeinstrom, der Signalwege aktiviert, die die SC-Proliferation, Dedifferenzierung und neurotrophe Faktorsekretion vorantreiben. Diese zellulären Reaktionen verbessern die axonale Unterstützung, das neuronale Überleben und die potenzielle Myelinisierung, was nsPEF als vielversprechendes Werkzeug für die Nervenreparatur hervorhebt.

Protokoll

1. Auftauen von kryokonservierten RSC96-Zellen

1. : Tauen Sie das Kryoröhrchen mit 1 ml Zellsuspension auf, indem Sie es in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell schütteln, dann in ein Zentrifugenröhrchen mit 4-6 ml vollständigem Kulturmedium geben und gut mischen.
2. Bei 1000 x g für 3-5 min zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die Zellen in 3 ml vollständigem Kulturmedium resuspendieren.
3. Die Zellsuspension wird in einen Kulturkolben (oder eine Schale) gegeben, der 6-8 ml vollständiges Kulturmedium enthält, und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
4. Beobachten Sie am nächsten Tag das Zellwachstum und die Zelldichte unter dem Mikroskop.

2. Zellpassage:

HINWEIS: Wenn die Zelldichte 80% -90% erreicht, ist sie bereit für den Durchgang.

1. Entsorgen Sie das Nährmedium und spülen Sie die Zellen 1-2 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium- und Magnesiumionen.
2. Geben Sie 0,25 % (w/v) Trypsin-0,53 mM EDTA in den Kulturkolben (1-2 mL für einen T25-Kolben, 2-3 mL für einen T75-Kolben) und inkubieren Sie ihn 1-2 Minuten lang bei 37 °C.
3. Beobachten Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop. Wenn die meisten Zellen rund werden und sich ablösen, stellen Sie den Kolben schnell wieder in den Arbeitsbereich, klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben und fügen Sie 3-4 ml Kulturmedium mit 10 % FBS hinzu, um den Verdau zu stoppen.
4. Den Inhalt mischen, die Lösung absaugen und bei 1000 x g 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie 1-2 ml frisches Kulturmedium hinzufügen und vorsichtig pipettieren.
5. Die Zellsuspension wird im Verhältnis 1:2 in einen neuen T25-Kolben überführt und 7 ml Kulturmedium hinzugefügt.

3. Betrieb des nsPEF-Geräts

:

1. Resuspendieren Sie die RSC96-Zellen in 1 mL DMEM-Kulturmedium und übertragen Sie sie in kolorimetrische Schalen mit Elektroden auf beiden Seiten.
2. Schalten Sie den Netzschalter ein.
3. Passen Sie die Parameter an, indem Sie den Knopf am Instrument drehen, um die Intensität des elektrischen Feldes zu ändern. Die in dieser Studie festgelegten Intensitäten betragen 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm und 40 kV/cm.
4. Drehen Sie die Elektroden vorsichtig, bis Funken entstehen, so dass die Zellen 5 Impulse von nsPEF entsprechend den voreingestellten Feldstärkeintensitäten empfangen können, bevor Sie die beiden Elektroden sofort trennen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hochspannungsnetzteil für nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Pipette	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
RSC96 Schwann-Zellen	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
Scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Spezialkabel für nsPEF	Times Mikrowellensysteme	M17/78-RG217