Eine virale Vektorinjektion in das Rückenmark der Ratte für die retrograde neuronale Verfolgung

Zusammenfassung

Quelle: Keefe, K. M., et al. Die direkte Injektion eines lentiviralen Vektors hebt mehrere motorische Bahnen im Rückenmark der Ratte hervor. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt die Injektion eines hocheffizienten retrograden Transportvektors (HiRet) in das Rückenmark von Ratten, um neuronale Signalwege zu verfolgen. Das Virus verfügt über Glykoproteine für den synaptischen Eintritt und ein fluoreszierendes Protein-kodierendes Gen. Die Nadel wird in das Rückenmark eingeführt und die Virussuspension wird mit einer kontrollierten Geschwindigkeit verabreicht. Die Nadel wird schließlich zurückgezogen, nachdem genügend Zeit für die Virusdiffusion gelassen wurde.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Präoperative Vorbereitungen

1. : Bereiten Sie gezogene Glasnadeln für die Virusinjektion einige Tage vor der Operation mit 3,5-Nanoliter-Glaskapillarpipetten vor, die für Nanoliter-Injektoren ausgelegt sind. Ziehen Sie jede Pipette an einem zweistufigen Nadelabzieher gemäß den Anweisungen des Herstellers, um Zweinadelschablonen zu erstellen.
2. Verfeinern Sie die Spitze der Nadelschablonen, indem Sie ca. 1-2 mm überschüssiges Glas mit einer Mikroschere abschneiden. Messen Sie die ungefähre Blendengröße unter einem Mikroskop mit einem Mikroskop-Kalibrierobjektträger, um Nadeln mit 30-40 μm Öffnungen zu isolieren.
3. Wenn die Nadel in einem Winkel von 30° positioniert ist, verwenden Sie eine Mikropipetten-Anfasmaschine, um eine Spitze mit einer Öffnung von 30-40 μm und einem abgeschrägten Winkel von 45° zu erzeugen. Überprüfen Sie die Blendenweite mit der Nonius-Skala auf dem Kalibrierungsträger. Führen Sie Wasser und Ethanol mit einer Spritze mit flexiblem Nadelaufsatz durch die Glasnadel, um Schmutz wegzuspülen, und markieren Sie die Nadel in regelmäßigen Abständen mit einem schwarzen Marker.
4. Legen Sie die Nadeln in eine abgedeckte Petrischale, die zuvor mit 70% Ethanol gereinigt wurde, und sterilisieren Sie sie 30 Minuten lang in einer Biosicherheitshaube unter ultraviolettem oder UV-Licht.
Bereiten Sie ein
5. hocheffizientes retrogrades Transport-Lentivirus (HiRet) vor, indem Sie unmittelbar vor dem Eingriff ein geeignetes Volumen aus dem Gefrierschrank entnehmen.
   HINWEIS: Ein geeignetes Volumen umfasst die für die Injektion erforderliche Menge (1 μl pro Injektion x Anzahl der Injektionen) plus eine kleine Menge an zusätzlichem Volumen, um Pipettier- und Ladeverluste zu berücksichtigen. Transportieren und lagern Sie das Virus bei Nichtgebrauch auf Eis.
6. Bereiten Sie den Injektor vor, indem Sie ihn an die Mikropumpe anschließen und in einen Mikromanipulator mit einer Nonius-Skala einsetzen.
7. Um die Glasnadel vorzubereiten, füllen Sie vorsichtig einen farbigen Farbstoff wie rotes Öl mit einer Spritze, die mit einer flexiblen Nadel ausgestattet ist. Achten Sie darauf, dass keine Blasen in der Nadel verbleiben. Verwenden Sie beim Umgang mit der Nadel eine aseptische Technik und berühren Sie die Spitze nicht.
8. Führen Sie die Glasnadel in den Injektor ein und stellen Sie sicher, dass die Nadel richtig in den Unterlegscheiben sitzt, die Injektorkappe fest angeschraubt ist und die Stahlinjektornadel etwa 3/4 der Länge der Glasnadel ausgefahren ist. Viren können in einem späteren Schritt in die Nadel geladen werden.

2. Anästhesie und Vorbereitung der Operationsstelle

1. : Wiegen Sie das Tier auf einer digitalen Waage. Erfassen Sie das präoperative Gewicht, um das erforderliche Anästhesievolumen zu bestimmen und das Gewicht nach der Operation überwachen zu können. Weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200–250 g wurden in diesem Protokoll verwendet.
2. Betäuben Sie die Ratte entweder mit Isofluran-Inhalation oder einer injizierten Ketamin/Xylazin-Lösung (k/x). Hier wird Ketamin intraperitoneal in einer Dosierung von 67 mg/kg und Xylazin in einer Dosierung von 6,7 mg/kg injiziert.
3. Bestätigen Sie eine geeignete Anästhesieebene, indem Sie den Fuß fest einklemmen. Wenn ein reflexartiger Entzug auftritt, warten Sie einige weitere Minuten, bevor Sie fortfahren.
   HINWEIS: Beobachten Sie auch die Schnurrhaare, die Augen und die Atemfrequenz auf Anzeichen von Bewusstsein. Wenn die Schnurrhaare zucken, das Auge blinzelt, wenn es sanft berührt wird, oder die Atmung schnell und flach ist, warten Sie, bis die Anästhesieebene tiefer ist, um mit dem Protokoll fortzufahren. Überwachen Sie diese Anzeichen auch während der Laminektomie und der Injektionsoperation. Wenn das Tier eine flache Anästhesieebene aufweist, verabreichen Sie eine Auffrischungsimpfung mit Ketamin, die nur der Hälfte der ursprünglichen k/x-Dosis entspricht.
4. Rasieren Sie die Ratte entlang der dorsalen Mittellinie von den Hüften bis zum unteren Winkel der Schulterblätter. Ziehen Sie die Haut des Tieres straff, um eine einfachere und präzisere Rasur zu ermöglichen.
5. Tragen Sie die Augensalbe auf beide Augen auf.
6. Tragen Sie ein Antiseptikum auf die rasierte Stelle auf, um die Stelle zu sterilisieren. Für das erste Peeling tränken Sie sterile Gaze mit einer 5%igen Jodlösung und wischen Sie alle Haare und Ablagerungen ab. Ziehen Sie anschließend in eine einseitige Richtung mit steriler, in 70 % Ethanol getränkter Gaze, damit kein Bereich zweimal berührt wird. Wenden Sie die gleiche Technik mit abwechselnd in Jod und Ethanol getränkter Gaze noch zweimal an.

3. Vorbereitung des Operationsfeldes und der Instrumente

1. Bereiten Sie ein Set autoklavierter chirurgischer Instrumente vor, die ein Skalpell, Rongeure, eine Rattenzahnzange, eine Federschere, Hämostaten, eine mittelpunktförmige gebogene Pinzette und Retraktoren oder gewichtete Haken enthalten, indem Sie die sterile Hülle auswickeln, um ein steriles Feld zu erstellen.
2. Öffnen Sie eine Packung steriler OP-Handschuhe und legen Sie die sterile Handschuhbandage auf den Tisch. Nutzen Sie dies als zusätzliches steriles Feld für gebrauchte Werkzeuge, um eine Kontamination der sterilen Hülle zu verhindern.
3. Lassen Sie eine #10 Skalpellklinge auf das sterile Feld fallen. Befestigen Sie die Klinge an einem Griff mit Hämostaten. Positionieren Sie sterile Kochsalzlösung, 4.0 Chrom-Catgut-Naht und Materialien zur Blutungskontrolle wie einen Kauterisator, sterile Gaze, sterile Applikatoren mit Wattespitze (für Muskelblutungen) oder Gelschaum oder Knochenwachs (für Knochenblutungen) an einer zugänglichen Stelle.
4. Holen Sie das Tier zurück und legen Sie es auf ein steriles Tuch. Lege Gaze unter die Blase, um den Urin aufzufangen. Stützen Sie den Zielbereich mit einem zusammengerollten Handtuch unter dem Bauch ab. Falls verfügbar, legen Sie ein chirurgisches Heizkissen unter das sterile Tuch, insbesondere bei längeren Eingriffen.
   HINWEIS: Sterilität ist während der Überlebensoperation wichtig. Halten Sie eine Sprühflasche mit 70 % Ethanol bereit, um die Sterilität der behandschuhten Hände zu erhalten, und verwenden Sie einen Bead-Sterilisator, wenn die Sterilität der Instrumente beeinträchtigt ist, oder zwischen einzelnen Operationen.

4. Freilegen der Wirbelsäule und Identifizieren der Laminektomiestelle

1. Identifizieren Sie den Bereich, in dem ein Hautschnitt vorgenommen wird, indem Sie mit den Fingern leicht auf die letzte Rippe drücken, um den Lendenwirbel oder L1-Wirbel zu lokalisieren. Nehmen Sie dies als Orientierungspunkt, machen Sie einen 3-4 cm langen Hautschnitt mit einem chirurgischen Skalpell #10, das knapp unterhalb von L1 endet, um den Muskel freizulegen. Halten Sie die Haut straff, indem Sie sie sanft verteilen und mit der Skalpellklinge fest andrücken, um einen sauberen Schnitt zu gewährleisten.
2. Schneiden und verteilen Sie oberflächliches Fett bei Bedarf mit Pinzette und Schere. (Abhängig vom Zielwirbel kann es ein großes Fettpolster geben, das an der Oberfläche des Muskels liegt.)
3. Fühlen Sie mit der flachen Skalpellklinge oder einem Finger nach den Dornfortsätzen. Oft wird der Mittellinienbereich auf beiden Seiten durch ein "V" aus weißen Faszien umrandet. Machen Sie einen kleinen rostralen Schnitt, damit Sie sich mit einer Rattenzahnzange sicher an einem oberen Prozess festhalten können, und machen Sie dann zwei lange, tiefe Schnitte so nah wie möglich an den Prozessen. An der tiefsten Stelle des Schnittes kann die dorsale Oberfläche der Wirbel mit der Skalpellklinge ertastet werden.
4. Halten Sie die seitlichen Muskeln mit Retraktoren oder gewichteten Haken zur Seite, um die Sicht zu verbessern. Reinigen Sie die Muskeln um die Fortsätze herum mit einem Skalpell, einer Federschere oder einem Rongeur, um die Form ihres Kopfes zu bestimmen.
   HINWEIS: Denken Sie daran, dass sich das Rückenmark nicht über die gesamte Länge der Wirbelsäule erstreckt, da das Rückenmarksgewebe früher in der Entwicklung aufhört zu wachsen als der Knochen. Dies bedeutet, dass sich die Zielwirbelsäule unter einem anders benannten Wirbel befinden kann.
5. Lokalisieren Sie den thorakalen oder T11 und die angrenzenden T12- und T13-Fortsätze.
   HINWEIS: Hilfe bei der Bestimmung der korrekten Wirbelhöhe finden Sie in einem Rückenmarksatlas der Ratte und früheren Studien, die Orientierungspunkte bei der Maus skizzieren, die eine sehr ähnliche Wirbelstruktur aufweist6,33. Lassen Sie einen rostralen Dornfortsatz, wie z. B. T9, ungestört, um einen Orientierungspunkt in der Mittellinie zu erhalten.

5. Durchführung einer Laminektomie

1. Nachdem der Zielbereich korrekt identifiziert wurde, führen Sie eine Laminektomie der dorsalen Aspekte von T11-T13 durch. Spreizen Sie die Wirbel vorsichtig, um die Zwischenwirbelbänder freizulegen, die gute Stellen sind, um Rongeure für den ersten Knochenbiss einzusetzen. Halten Sie die Rongeurs in einer halbgeschlossenen Position, um die Feinsteuerung zu erhöhen.
2. Entfernen Sie die Dornfortsätze und den dorsalen Aspekt der Wirbel, indem Sie kleine Bissen mit den Rongeuren nehmen. Achte darauf, das Rückenmark nicht zu beschädigen oder die Dura zu stören. Hebe sie mit der Rattenzahnzange leicht an, um das Rückenmark von den Wirbeln wegzuziehen und die Neigung zum Schlag auf das Rückenmarksgewebe zu verringern.
3. Befreien Sie den Knochen von der Mittellinie, so dass das Blutgefäß in der Mittellinie sichtbar sein kann. Lassen Sie ein Fenster, das das Rückenmarksgewebe deutlich sichtbar und frei von Ablagerungen ist.
4. Berühren Sie das Rückenmark vorsichtig mit einer Pinzette. Einige Tiere können reflexartig springen, auch wenn ihre Anästhesieebene tief ist. Tragen Sie einige Tropfen eines Betäubungsmittels wie Lidocain direkt auf das Rückenmark auf, um ein Springen während des Injektionsvorgangs zu verhindern.
5. Sichern Sie das Tier in einer Wirbelsäulenhalterung, indem Sie eine stabilisierende Pinzette an den Dornfortsätzen rostral und kaudal am Laminektomiefenster befestigen. Heben Sie den Bauch des Tieres mit dem Wirbelsäulenhalter an, um den Effekt von Atembewegungen zu negieren. Dies erhöht die Stabilität der Nadel und sorgt für die richtige Injektionstiefe.

6. Laden des Virus und Positionieren des Injektors

1. Laden Sie das Virus in den Injektor, indem Sie ca. 5 μl auf ein Stück Parafilm pipettieren und die Nadel so positionieren, dass sich die Spitze im Tropfen befindet.
2. Verwenden Sie die Mikropumpe, um bis zu 4 μl Virus mit einer Geschwindigkeit von 20–100 nL/s zu entnehmen.
3. Stellen Sie den Controller so ein, dass eine kleine Menge Virus aus der Nadel injiziert und freigesetzt wird, um sicherzustellen, dass die Spitze der Nadel nicht blockiert wird. Wischen Sie überschüssige Viren mit einem Labortuch ab.
   HINWEIS: Eine Hamilton-Spritze mit einer Stahlnadel kann als Alternative zu gezogenen Glaspipetten verwendet werden.
4. Positionieren Sie den Mikromanipulator so, dass die Nonius-Skala sichtbar ist, und positionieren Sie die Nadel an der Mittellinie des Rückenmarks.
   HINWEIS: Die Mittellinie kann manchmal durch ein großes Blutgefäß lokalisiert werden, das auf der vorderen Oberfläche des Rückenmarks verläuft. Dies kann jedoch bei einzelnen Ratten variieren, und das Midline-Targeting sollte durch den Vergleich mit einem intakten Dornfortsatz bestätigt werden.
5. Richten Sie die Nadel mit der Nonius-Skala am Mikromanipulator um 0,8 mm seitlich aus.
6. Senke die Nadel auf das Rückenmark, bis sie die Dura einkerbt, aber nicht durchsticht. Mit einer schnellen Drehbewegung die Dura mit der Nadel einstechen, bis sie bis zu einer Tiefe von 1,5 mm eingesunken ist.

7. Injizieren des Virus in das Rückenmark

1. Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, programmieren Sie den Injektor so, dass er mit einer Geschwindigkeit von 400 nL/min injiziert. Bestätigen Sie, dass das Virus in das Rückenmark eindringt, indem Sie den Fortschritt der Farbstofffront beobachten. Es sollte keine offensichtliche Leckage oder Ausbeulung des Rückenmarksgewebes geben. Wenn eine Leckage beobachtet wird, kann dies manchmal durch eine Reduzierung der Einspritzgeschwindigkeit auf 200 nL/min gemildert werden.
2. Lassen Sie die Nadel nach Beendigung der Injektion 2–5 Minuten lang (je nach injiziertem Volumen) im Rückenmark ruhen, um die Diffusion des Virus zu erleichtern.
3. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück und begeben Sie sich zur nächsten Injektionsstelle. Injizieren Sie jeweils 1 μl Virus in eine von 6 gleichmäßig verteilten Stellen, die etwa 1 mm entlang der Länge des L1-L4-Rückenmarksgewebes voneinander entfernt sind. Für jede Injektion kann dieselbe Nadel verwendet werden, solange sie weiterhin ordnungsgemäß funktioniert.

8. Wundverschluss und postoperative Pflege

1. Nehmen Sie das Tier aus der Wirbelsäulenhalterung und nehmen Sie Retraktoren oder Haken heraus, die zum Spreizen der Seitenmuskulatur verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Wunde frei von allen Ablagerungen ist, bevor Sie sie schließen.
2. Nähen Sie den Muskel mit einer 4.0 Chromic Catgut-Naht. Schneiden Sie die Nahtfäden in der Nähe des Knotens ab, um die Wahrscheinlichkeit von inneren Hautreizungen zu verringern.
3. Heften Sie die Haut mit 9 mm gewickelten Klammern zu. Um eine optimale Heilung zu ermöglichen, richten Sie die Ränder der Haut vor dem Heften aus.
4. Legen Sie das Tier auf ein Wasserkonvektions-Wärmekissen und überwachen Sie es, bis es wach ist.
5. Injizieren Sie 5–10 ml sterile Kochsalzlösung subkutan, um Flüssigkeiten und ein Antibiotikum wie Cefazolin aufzufüllen, um eine Infektion zu verhindern. Wenn das Tier gehfähig ist, setzen Sie es zurück in seinen Heimatkäfig und geben Sie erste Analgetika. Überwachen Sie die Ratten auf Anzeichen von Schmerzen und Beschwerden und behandeln Sie sie gemäß dem von Ihrem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Verfahren zur Schmerzlinderung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
#10 Skalpellklingen	Roboz	RS-9801-10	Zur Verwendung mit dem Skalpell.
1-ml-Spritzen	Becton, Dickinson and Company	Für anästhetische IP-Injektionen, potenzielle Anästhesie-Auffrischungsimpfungen und Antibiotika-Injektionen.
10-ml-Spritzen	Becton, Dickinson and Company	309604	Zur Injektion von Kochsalzlösung in das Tier nach der Operation.
4.0 Chromic Catgut Naht	DemeTECH	NN374-16	Zur erneuten Bindung des Muskels während des Schließens.
48000 Mikropipette Anfaser	World Precision Instruments	32416	Wird verwendet, um die Spitzen der gezogenen Glaskapillarrohre abzuschrägen, um funktionelle Glasnadeln zu formen.
5% Jodlösung	Purdue Products L.P.	L01020-08	Zur Verwendung bei der Sterilisation des Operationsfeldes.
70% Ethanol	N/A	N/A	Für die Sterilisation von neu präparierten Glasnadeln, Tiermodellen während der chirurgischen Vorbereitung und Chirurgenhänden während der Operation, sowie alle anderen geringfügigen Aufrechterhaltungen der Sterilität.
Anästhetikum (Ketamin/Xylazin-Lösung)	Zoetis	240048	Um das Tier während der Operation in der richtigen Bewusstseinsebene zu halten.
Antibiotikum (Cefazolin)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	Zur subkutanen Injektion zur Vorbeugung von Infektionen nach der Operation.
Bead-Sterilisator	CellPoint	5-1450	Zur Wärmesterilisation von chirurgischen Instrumenten.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	Zur Versiegelung von Knochen bei Knochenblutungen.
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00	Zur Versiegelung von Arterien oder Venen, die während der Operation durchtrennt wurden, um übermäßigen Blutverlust zu verhindern.
Digitalwaage	Okaus	REV.005	Zum Wiegen des Tieres während der chirurgischen Vorbereitung.
Flexibler Nadelaufsatz	World Precision Instruments	MF34G-5	Zum Reinigen von Glasnadeln und zum Befüllen von Glasnadeln mit rotem Öl.
Gelfoam	Pfizer	H68079	Zur Versiegelung des Knochens bei Knochenblutungen.
Glaskapillarrohre	World Precision Instruments	4878	Für gezogene Glasnadeln - sollten für Nanoliter-Injektoren ausgelegt sein.
Haarschneider	Oster	111038-060-000	Zum Reinigen der Operationsstelle von Haaren.
Hämostatika	Roboz	RS-7231	Für den allgemeinen Gebrauch in der Chirurgie.
Kimwipes	Kimtech	34155	Für den allgemeinen Gebrauch in der Chirurgie.
Gebogene Zange mit mittlerem Punkt	Roboz	RS-5136	Für den allgemeinen Einsatz in der Chirurgie.
Mikromanipulator mit einer Nonius-Skala	Kanetec	N/A	Für präzises Zielen während der Operation.
Mikroschere	Roboz	RS-5621	Zum Schneiden von Glasflüstern von frisch gezogenen Glaskapillarrohren.
Mikroskop mit Licht- und Nonius-Skala Okular	Leitz Wetzlar	N/A	Dient zur Visualisierung und Messung der Abschrägung von gezogenen Glaskapillarrohren zu funktionsfähigen Glasnadeln.
Steuerung der MikroSpritzenpumpe	World Precision Instruments	62403	Zur Steuerung der Injektionsrate.
Nanoliter 2000 Pumpenkopf-Injektor	World Precision Instruments	500150	Zum kontrollierten Laden und Injizieren von Viren.
Nadelabzieher	Narishige	PC-100	Zum Erhitzen und Auseinanderziehen von Glaskapillarrohren zu Glasnadeln.
Ophthalamische Salbe	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	Zum Schutz der Augen des Tieres während der Operation.
Parafilm	Bemis	PM-996	Zur Unterstützung des Ladens von Viren in den Nanoinjektor.
PrecisionGlide Nadeln (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Zur Verwendung mit den 1-ml- und 10-ml-Spritzen, um die Injektion des Tiermodells zu ermöglichen.
Rattenzahnzange	Roboz	RS-5152	Zum Greifen von Dornfortsätzen.
Rotes Öl	N/A	N/A	Zur Bereitstellung einer Front für die Visualisierung von Viren, die während der Injektion in das Gewebe eindringen.
Retraktoren	Roboz	RS-6510	Um die Operationswunde offen zu halten.
Rimadyl Tabletten	Bio Serv	MP275-050	Zur Schmerzbehandlung nach der Operation.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Zur Entfernung von Muskeln aus der Wirbelsäule während der Operation.
Skalpellklingengriff	Roboz	RS-9843	Zum Aufschneiden der Haut und des Fettpolsters eines Tiermodells während der Operation.
Schere	Roboz	RS-5980	Für den allgemeinen Einsatz in der Chirurgie.
Wundclips aus rostfreiem Stahl	CellPoint	201-1000	Zum Abbinden der Haut der Operationswunde während des Schließens.
Zange zum Entfernen von Klammern	Kent Scientific	INS750347	Um die Klammern zu entfernen, wenn sie falsch angebracht wurden.
Steriles Tuch	Phenix Research Products	BP-989	Um eine sterile Oberfläche für die Operation bereitzustellen.
Sterile Applikatoren mit Wattespitze	Puritan	806-WC	Zum Aufsaugen von Blut in der Operationswunde unter Beibehaltung der Sterilität.
Sterile	Gaze Covidien	2146	Zur Reinigung des Operationsbereichs und der chirurgischen Instrumente unter Beibehaltung der Sterilität.
Sterile Kochsalzlösung	Baxter Healthcare Corporation	281324	Zur Verwendung bei der Blutreinigung und zum Ersatz von Flüssigkeiten nach der Operation.
OP-Handschuhe	N/A	N/A	Zur Verwendung durch den Chirurgen, um ein steriles Feld während der Operation zu erhalten.
Chirurgisches Heizkissen	N/A	N/A	Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur des Tiermodells während der Operation.
Operationsmikroskop	N/A	N/A	Zur besseren Visualisierung der Operationswunde.
Chirurgisches Klammergerät	Kent Scientific	INS750546	Zum Auftragen der Klammern.
T/Pump Wärmetherapie-Wasserpumpe	Gaymar	TP500C	Zum Pumpen von warmem Wasser in das Wasserkonvektions-Wärmekissen.
Wasser-Konvektions-Wärmekissen	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Für den Einsatz im postoperativen Erholungsbereich, um die Körpertemperatur des bewusstlosen Tieres aufrechtzuerhalten.
Gewichtete Haken	N/A	N/A	Zum Offenhalten der Operationswunde.

309659