Hochintensiver fokussierter Ultraschall zur Blockierung von Nervenaktionspotentialen in einem diabetischen Rattenmodell

Zusammenfassung

Quelle: Lee, Y. F., et al. Ein Ultraschallgerät für Nervenleitungsblockaden in diabetischen Rattenmodellen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Verwendung von hochintensivem fokussiertem Ultraschall (HIFU) zur Blockierung von Aktionspotentialen vom Ischiasnerv zum Gastrocnemius-Muskel in einem diabetischen Rattenmodell. Nach der Abgabe des HIFU-Strahls an den Nerv bestätigt eine Abnahme des Muskelsignals das Potenzial von HIFU als nicht-invasive Therapie zur Linderung diabetischer neuropathischer Schmerzen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. In-vivo-Blockade der Nervenleitung mit dem HIFU-Schallkopf (High-Intensity Focused Ultrasonic)

HINWEIS: Das In-vivo-Experiment beginnt in Woche 5 nach einer Injektion von 50 mg/kg Streptozotocin (STZ).

1. Führen Sie tierische Eingriffe durch, bevor Sie die zusammengesetzten Muskelaktionspotentiale (CMAPs) mit HIFU-Ultraschall blockieren.
   1. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente (Skalpell, Schere, Pinzette und Glashaken) vor der Operation in einem Autoklaven.
   2. Betäuben Sie die Ratten mit einer intraperitonealen Injektion eines Tiletamin/Zolazepam-Gemisches (40 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) oder durch Inhalation von 1,75 % Isofluran über einen Isofluran-Verdampfer. Legen Sie die Ratten auf ein Heizkissen, um ihre Körpertemperatur zu halten.
   3. Positionieren Sie die Ratten für die Operation in Bauchlage. Tragen Sie die Augensalbe auf. Strecken Sie das Bein der Ratte aus und kneifen Sie mit den Fingernägeln in die Plantarfläche des Fußes, um die Narkosetiefe zu bestimmen. Wenn die Ratten Entzugsreaktionen zeigen, wenden Sie eine zusätzliche Anästhesie an
   .
   4. Entfernen Sie die Haare am Oberschenkel und am unteren Rücken der Ratten mit einer elektrischen Schermaschine. Tragen Sie flüssiges Jod mit sauberer Gaze auf die Operationsstelle auf und bewegen Sie die Gaze kreisförmig von der Operationsstelle nach außen. Verwenden Sie ein Alkoholpad, um das flüssige Jod mit den gleichen kreisenden Bewegungen abzuwischen. Dieses Experiment wird an der linken und rechten Operationsstelle durchgeführt. Wiederholen Sie den Vorgang an der anderen Operationsstelle, wenn Sie den nächsten Schritt des Eingriffs durchführen.
   5. Verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere oder ein Skalpell, um einen Schnitt in die Haut am hinteren Oberschenkel zu machen. Trennen Sie das Gewebe unter der Haut vorsichtig mit einer stumpfen chirurgischen Schere und sichern Sie die Haut mit Hauthaken. Der Oberschenkelknochen ist innerhalb der Muskeln zu sehen.
   6. Trennen Sie die Muskeln mit einer Schere vorsichtig parallel zum Oberschenkelknochen, bis die in die Muskeln eingebetteten Ischiasnervenfasern in der Mitte des Oberschenkels sichtbar sind. Trennen Sie den Ischiasnerv in der Mitte des Oberschenkels vorsichtig mit einem Glashaken vom umgebenden Bindegewebe und den Muskeln.
2. Positionieren Sie den Ischiasnerv mit einem individuell angefertigten Nervenfixateur in der HIFU-Brennzone (Abbildung 1 und Abbildung 2).
   HINWEIS: Der individuell angefertigte Nervenfixateur besteht aus 3 Komponenten (Abbildung 2). Alle Komponenten bestehen aus transparentem Polymethylmethacrylat (PMMA). Das Außengewinde der oberen Struktur von Bauteil I ist 2,5 mm hoch und M10XP0,7 (Bild 3A). Die zentrale Vertiefung ist ein Loch mit einem Durchmesser von 4,0 mm durch Bauteil I. Die untere Öffnung des Brunnens ist mit einem Blatt Klebeband abgedichtet. Der Durchmesser der Nut beträgt 1,2 mm, und der Abstand zwischen der Mittelebene der Nut und der Oberseite des Bauteils I beträgt 3,1 mm. Komponente II besteht aus einem Hauptkörper, vier Beinen und der unteren Struktur (Abbildung 3B). Das Innengewinde der unteren Struktur ist 2,5 mm hoch und M10XP0,7 passend für das Außengewinde von Bauteil I. Der Durchmesser der zentralen Bohrung entspricht dem der zentralen Vertiefung von Komponente I. Die Abmessungen des Hauptkörpers betragen 32 mm im Durchmesser und 5,4 mm in der Dicke. Vier Beine sind symmetrisch ausgeklappt. Zwei identische kurze Beine sind für die Ausrichtung ausgelegt, und zwei identische lange Beine dienen zum Einhaken an Komponente III. Der Außendurchmesser und die Höhe des Bauteils III betragen 41 mm und 9,2 mm. Das Innengewinde ist M36XP1.0 und die Durchgangsbohrung hat einen Durchmesser von 27,5 mm (Abbildung 3C). Der Kegel ist ein Hohlkegel mit einer oberen Öffnung von 84 mm Durchmesser und einer unteren Öffnung von 27,5 mm Durchmesser. Die Höhe beträgt 57,5 mm (Abbildung 4A).
   1. Vor dem Experiment den speziell angefertigten Acryl-Nervenfixateur für 30 - 60 Minuten in Bleichlösung einweichen, anschließend in sterilem Wasser einweichen.
   2. Heben Sie den Nerv vorsichtig mit einem Glashaken an und stecken Sie ihn in den Schlitz von Komponente I.
   3. Verschrauben Sie Komponente II mit Komponente I. Füllen Sie die zentrale Vertiefung von Komponente I mit Ringer-Lösung für die Ultraschallausbreitung und den Nervenerhalt.
   4. Bauteil III an den HIFU-Gehäusekonus schrauben. Docken Sie Komponente III mit Komponente II durch die vier Schenkel von Komponente II an.
      HINWEIS: Der geometrische Mittelpunkt der drei Komponenten und der Wandler sind ausgerichtet. Der Abstand zwischen dem Nerv und dem Schallkopf entspricht der Brennweite, wodurch sichergestellt wird, dass sich der Nerv innerhalb der HIFU-Fokuszone befindet.
3. Führen Sie ein Paar Akupunkturnadeln in den Ursprung des Ischiasnervs und das andere Paar in den Musculus gastrocnemius ein. Verbinden Sie jedes Nadelpaar über ein elektrisches Koaxialkabel mit dem elektrophysiologischen Erfassungssystem (Abbildung 1).
   HINWEIS: An einem Ende des Kabels befinden sich zwei Krokodilklemmen, mit denen zwei Nadeln separat befestigt werden können, und am anderen Ende des Kabels befindet sich ein Bajonett-Neill-Concelman-Anschluss (BNC), um das System zu verbinden. Die Akupunkturnadelpaare fungieren als Stimulationselektroden am Ischiasnerv und als Aufzeichnungselektroden am Musculus gastrocnemius.
   1. Setze die Abtastrate und Bandbreite des elektrophysiologischen Erfassungssystems auf 50 kHz bzw. 70 Hz-3 kHz. Wenden Sie einen supramaximalen Stimulus mit einer Pulsbreite von 0,1 ms an die Stimulationselektroden am Ursprung des Ischiasnervs an.
   2. Nehmen Sie die CMAPs von den Aufzeichnungselektroden auf und verstärken Sie die CMAPs mit dem eingebauten Verstärker im Elektrophysiologie-Erfassungssystem.
      HINWEIS: Verwenden Sie den eingebauten Verstärker im Elektrophysiologie-Erfassungssystem, um die Nervensignale zu verstärken, und zeichnen Sie die CMAPs von den Aufzeichnungselektroden mit dem Elektrophysiologie-Erfassungssystem auf.
4. Verwenden Sie einen handelsüblichen 2,68 MHz HIFU-Schallkopf, um die CMAPs bei diabetischen neuropathischen Ratten zu suppressieren.
   HINWEIS: Die Spezifikationen des Schallkopfes werden wie folgt beschrieben: eine kugelförmige Schale mit einem Ein-Element-Öffnungsdurchmesser von 6 cm und einer Brennweite von 5 cm und einer ellipsoiden Fokuszone von 4 mm Tiefe und 0,8 mm Breite im Freifeld.
   1. Tauche den kugelförmigen Kegel, den HIFU-Geber und die Kegelabdeckung in den mit entgastem Wasser gefüllten Tank. Setzen Sie den HIFU-Wandler in den Kugelkegel ein und befestigen Sie die Konusabdeckung mit sechs Kopfschrauben an der oberen Öffnung des Kugelkegels (Abbildung 4B). Nachdem die Blasen im kugelförmigen Kegel aufgrund der im Vergleich zu Wasser geringen Blasendichte auf natürliche Weise ausgestoßen werden, versiegeln Sie die vordere Öffnung des Kegels mit einem transparenten 0,03 mm dicken Klebeband. Bauteil III auf den Kugelkegel schrauben.
   2. Nehmen Sie den HIFU-Wandler mit dem kugelförmigen Kegel und der Komponente III aus dem entgasten Wasserbehälter.
      HINWEIS: Das in der Studie verwendete Umkehrosmosewasser (RO) ist das Wasser, das durch den Prozess der Umkehrosmose gereinigt wurde. Das RO-Wasser wird gekocht, um das Gas auszustoßen. Nach dem Abkühlen wird das entgaste Wasser in einem einzeln verschlossenen Tank gewonnen.
5. Setzen Sie Komponente I vorsichtig in den Raum zwischen dem Nerv und dem Muskel ein und positionieren Sie den Nerv in der Lücke von Komponente I. Führen Sie die Schritte 1.2.3 und 1.2.4 durch, um sicherzustellen, dass sich der Nerv innerhalb der Fokuszone des HIFU befindet (Abbildung 2A).
6. Verbinden Sie einen Funktionsgenerator und eine Hochfrequenz-Endstufe. Verbinden Sie den Leistungsverstärker mit dem HIFU-Wandler, um den HIFU-Strahl zu erzeugen. Stellen Sie den Spannungsausgang des Funktionsgenerators manuell über die Endstufe auf den HIFU-Wandler ein. Schalten Sie den Funktionsgenerator manuell aus, sobald die HIFU-Belichtungszeit abgelaufen ist. Beobachten Sie die Zeit mit einem Timer.
   HINWEIS: Die Intensität und Energie des in dieser Studie verwendeten HIFU-Strahls beträgt 2.810 W/cm² bzw. 84 J/mm².
7. Gleichzeitig wird der Stimulus über das elektrophysiologische Erfassungssystem (Schritt 1.3) und der HIFU-Strahl über das HIFU-System (Schritt 1.6) an den Ischiasnerv abgegeben, während die CMAPs aufgezeichnet werden. Erhöhen Sie allmählich die HIFU-Exposition am Ischiasnerv von 3 s, 5 s auf 8 s, bis eine Abnahme oder Hemmung der Amplitude der CMAPs beobachtet wird.
   1. Zeichnet die CMAPs einmal pro Sekunde während der Abgabe des HIFU-Strahls auf. Nachdem Sie die Änderung der Amplitude von CMAPs beobachtet haben, schalten Sie das HIFU-System aus und klicken Sie manuell auf das Aufnahmesymbol in der Elektrophysiologie-Erfassungssoftware, um CMAPs alle 2 Minuten in den frühen 10 Minuten, alle 5 Minuten in den aufeinanderfolgenden 30 Minuten und alle 10 Minuten in der letzten Phase aufzuzeichnen, bis die Aufnahmezeit 2 Stunden erreicht.
8. Trennen Sie die Komponenten II und III des Nervenfixateurs (Abbildung 2), um den HIFU-Schallkopf von der Inzisionsstelle zu entfernen. Trennen Sie die Komponenten II und I, um den gesicherten Ischiasnerv zu lösen. Vernähen Sie die Operationsstelle der diabetischen Ratte mit 4-0 chromischen Catgut-Nähten nach der Aufzeichnung der CMAPs. Tragen Sie flüssiges Jod auf die Operationsstelle auf, um eine Infektion zu verhindern.
   1. Stellen Sie die Käfige auf das Heizkissen und lassen Sie die Ratten sich in ihren Käfigen erholen, bevor Sie sie in die Tiereinrichtung zurückbringen. Geben Sie den Ratten 3 Tage lang Ibuprofen im Trinkwasser oder eine intraperitoneale Injektion von Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg).
9. Einsetzen Sie Stimulations- und Aufzeichnungselektroden in den Ursprung des Ischiasnervs und der Gastrocnemius-Muskeln von anästhesierten diabetischen neuropathischen Ratten, wie in den Schritten 1.1.2 und 1.3 beschrieben, an den Tagen 7, 14 und 28 nach der ersten HIFU-Beschallung.

Ergebnisse

Abbildung 1: Der Versuchsaufbau für den In-vivo-Nervenleitungsblock mit hochintensivem fokussiertem Ultraschall (HIFU). (A) Ein speziell angefertigter kugelförmiger Acrylkegel, der mit Umkehrosmose-entgastem Wass...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Streptozotocin	Sigma	85882
Biopac MP36 Erfassungssystem	Biopac Systems, Inc.
HIFU-Wandler	Sonic Concepts	H108
Funktionsgenerator	Agilent	33250A
Leistungsverstärker	Elektronik & Innovation	1040L
Ratten	Biolasco Taiwan	Sprague-Dawley
Puralube Tierarztsalbe	Dechra
Isofluran-Verdampfer	Parkland Scientific	V3000PS
Isofluran	Attane