Bildgebung der subzellulären Kalziumdynamik in Neuronen von Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Quelle: Doser, R., et al. Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Kalziumumgangs in vivo. J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video zeigt in vivo die Bildgebung des subzellulären Kalziumflusses in den ventralen Nervenstrangneuronen von transgenen Caenorhabditis elegans-Stämmen. Es werden zwei unterschiedliche Kalziumindikatoren verwendet: ein zytoplasmatischer Indikator in einem Stamm und ein mitochondrialer Indikator in einem anderen. Neuronen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um Änderungen der Fluoreszenzintensität im neuronalen Zytoplasma und in den Mitochondrien in Echtzeit zu überwachen und den Kalziumfluss während der spontanen neuronalen Aktivität widerzuspiegeln.

Protokoll

1. Vorbereitung von Würmern für

1. die Bildgebung Vorbereitung der Agarpads
   1. Stellen Sie 3 ml 10%igen Agar her, indem Sie Agar in molekularer Qualität in M9 in einem 13 mm x 100 mm großen Glaskulturröhrchen auflösen und einige Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen.
      HINWEIS. Geschmolzenes Agar kann bis zu 1 Stunde auf einem Heizblock aufbewahrt oder jedes Mal frisch zubereitet werden, wenn Agar-Pads benötigt werden.
   2. Legen Sie einen Objektträger zwischen zwei weitere Objektträger, die jeweils mit zwei Lagen Laborklebeband versehen sind (siehe Abbildung 1A-i).
   3. Schneiden Sie die Spitze einer 1.000-μl-Pipettenspitze (ohne Filter) ab und pipettieren Sie damit einen kleinen Tropfen Agar auf das mittlere Deckglas (Abbildung 1A-i).
   4. Glätten Sie den Agar, indem Sie einen weiteren Schieber auf den Agar drücken (Abbildung 1A-ii).
   5. Schneiden Sie den Agar nach dem Abkühlen mit der Öffnung eines 13 mm x 100 mm großen Glaskulturröhrchens in eine kleine Scheibe (Abbildung 1A-iii) und entfernen Sie dann den umgebenden Agar.
2. Vorbereitung der Wurmwalzlösung
   1. Muscimol-Pulver in M9 auflösen, um einen 30 mM Vorrat zu erhalten. In 50 μl Aliquot trennen und bei 4 °C lagern.
   2. Tauen Sie alle 3-5 Tage ein neues Aliquot von 30 mM Muscimol auf (und lagern Sie es während des Gebrauchs bei 20 °C).
   3. Verdünnen Sie einen 30 mM Muscimol-Stamm im Verhältnis 1:1 mit Polystyrolkügelchen, um die Walzlösung herzustellen.
3. Positionieren eines Wurms für die Bildgebung
   1. Geben Sie 1,6 μl der rollenden Lösung auf die Mitte des Agarpads.
      HINWEIS: Die Flüssigkeitsmenge sollte für die Bildgebung jüngerer (weniger) oder älterer Tiere (mehr) angepasst werden.
   2. Übertragen Sie mit dem bevorzugten Wurmpickel (d. h. einem Glas- oder Platindrahtpickel) einen Wurm des gewünschten Alters ohne den Multivulva-Phänotyp in die Rolllösung auf dem Agarpad (Abbildung 1A-iv). Anmerkung. Die repräsentativen Daten stammen von 1 Tag alten Hermaphroditen (GCaMP6f-Stamm = FJH185; mitoGCaMP-Stamm; FJH597), die durch das Vorhandensein von nur einer Reihe von Eiern identifiziert werden können.
   3. Warten Sie ~5 Minuten, bis das Muscimol die Wurmbewegung reduziert hat, und lassen Sie dann ein 22 mm x 22 mm großes Deckglas auf das Agarpad fallen, um die Wurmbewegung physisch einzuschränken.
   4. Zur Darstellung von Neuriten im ventralen Nervenstrang rollen Sie den Wurm in die in den Abbildungen 1B und 1C gezeigte Ausrichtung, indem Sie das Deckglas leicht verschieben.
      HINWEIS. Um den ventralen Nervenstrang sichtbar zu machen, positionieren Sie den Wurm mit dem Kopf nach oben und rollen Sie den Wurm, bis sich der Darm auf der rechten Seite des proximalen Teils und auf der linken Seite des distalen Teils des Wurms befindet (aus der Perspektive des Betrachters). Kehren Sie diese Ausrichtung um (Abbildung 1C) für die Abbildung von Neuriten im dorsalen Nervenstrang.
4. Montage des Wurms an einem Mikroskop
   1. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas, bevor Sie es auf den Mikroskoptisch montieren.
   2. Finde den Wurm mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (10x) im Hellfeld.
   3. Wechseln Sie zum 100-fach-Objektiv und stellen Sie den Fokus ein.
   4. Lokalisieren Sie den AVA-Neuriten mithilfe der Beleuchtung des GCaMP oder mitoGCaMP mit dem 488-nm-Bildgebungslaser.
      HINWEIS: Nehmen Sie kleine Anpassungen vor, um ein Quetschen des Wurms oder das Abziehen des Deckglases zu verhindern.

2. Aufnahme von hochauflösenden Bildströmen

1. In vivo GCaMP-Bildgebung
   1. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 ms ein.
   2. Passen Sie den Bildbearbeitungslaser und die Aufnahmeeinstellungen an, bis die basale GCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich des Dynamikbereichs der Kamera liegt. In der Diskussion finden Sie Vorschläge zur Optimierung der Bildgebungsparameter mit anderen Mikroskopie-Setups.
      HINWEIS: Stellen Sie für den in dieser Studie verwendeten optischen Aufbau den 488-nm-Bildgebungslaser auf die folgenden Ausgangseinstellungen ein: Laserleistung = 50 % und Dämpfung = 1. Ändern Sie die zusätzlichen Erfassungseinstellungen wie folgt: EM-Elektronenmultiplikation) Verstärkung = 200 und Vorverstärkerverstärkung = 1.
   3. Nachdem der AVA-Neurit mit Hilfe der GCaMP-Fluoreszenz bei 100-facher Vergrößerung lokalisiert wurde, stellen Sie den Z-Drift-Korrektor (ZDC, siehe Materialtabelle) auf einen Bereich von ±30 μm ein und starten Sie den kontinuierlichen Autofokus. Korrigieren Sie die Fokusebene vor der Bildgebung bei Bedarf manuell.
   4. Erfassen Sie einen Bilderstrom mit 100-facher Vergrößerung. Dauern von bis zu 10 Minuten können mit dem in dieser Studie verwendeten Setup erreicht werden.
2. In vivo mitoGCaMP imaging
   1. Führen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.1.2 nach Bedarf aus, um die basale mitoGCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich für den Dynamikbereich der Kamera zu erfassen.
      HINWEIS. Für den in dieser Studie verwendeten optischen Aufbau stellen Sie den 488-nm-Bildgebungslaser auf die folgenden Ausgangseinstellungen ein: Laserleistung = 20 % und Dämpfung = 10. Ändern Sie die Aufnahmeeinstellungen wie folgt: EM-Verstärkung = 100 und Vorverstärkerverstärkung = 2.
   2. Nachdem die Mitochondrien im AVA-Neurit mit Hilfe der mitoGCaMP-Fluoreszenz lokalisiert wurden, setzen Sie die ZDC wie oben in Schritt 2.3 beschrieben.
   3. Erfassen Sie einen Bilderstrom mit 100-facher Vergrößerung.

Ergebnisse

Abbildung 1: Montage und Rollen von C. elegans zur Abbildung des ventralen Nervenstrangs. (A) Eine Abbildung der Schritte zur Vorbereitung der Agar-Pads und zum Pflücken eines einzel...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100x/1.40 Ölobjektiv	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objektiv	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Deckglas	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
CleanBench Labortisch	TMC		Mit Vibrationskontrolle
Filterrad oder Schieber	ASI		Für Filter mit 25 mm Durchmesser
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Wurmstamm
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Wurmstamm
GFP Bandpass-Emissionsfilter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm Durchmesser)
ILE Laser Combiner	Andor Technologies		4 Laserlinien
ILE Festkörper 488 nm Laser	Andor Technologies		50 mW
IX83 Konfokales Spinning-Disk-Mikroskop	Olympus		Mit Yokogawa CSU-X1 Spinning Disc
iXon Ultra EMCCD Kamera	Andor Technologies
Niedriges Autofluoreszenz-Immersionsöl	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Mikroskop-Steuerbox	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
Polybead-Mikrosphären	Polysciences Inc.	00876-15	0,094 μm
Stabilitätskammer	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set auf 15 °C
Tischregler	ASI		Mit Filterradsteuerung
Standard-Objektträger	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touchpanel-Controller	Olympus		I3-TPC
Z-Drift-Korrektor	Olympus		IX3-ZDC2