Transplantation von Interneuronen-Vorläuferzellen in das Gehirn eines Mäusewelpen

Zusammenfassung

Quelle: Quattrocolo, G., et al. Homochrone Transplantation von Interneuronen-Vorläufern in frühe postnatale Mäusegehirne. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Transplantation von Interneuronen-Vorläuferzellen in das neonatale Mausgehirn unter Verwendung eines homotopen oder heterotopen Ansatzes. Das Verfahren umfasst die Sicherung eines anästhesierten Empfänger-Welpen, die Identifizierung der Zielhirnregion und die Injektion einer Suspension von Vorläuferzellen, die von einem Spender-Welpen im selben Entwicklungsstadium stammen. Nach der Injektion wird das Jungtier zur Genesung auf ein Wärmekissen gebracht, das eine anschließende Bewertung des Überlebens und der Reifung der Spenderzellen ermöglicht.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Entnahme des P0-P2-Mausgehirns

1. Unmittelbar vor Beginn des Eingriffs füllen Sie mehrere Petrischalen mit gekühlter, carboxygenierter Saccharose künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (sACSF). Füllen Sie auch die Sammelröhrchen mit ~25 mL sACSF.
2. Wickeln Sie einen Welpen am postnatalen Tag 0 bis 2 (P0-P2) in etwas Parafilm oder einen Handschuh und legen Sie ihn gut abgedeckt unter das Eis. Stellen Sie einen Timer auf 5 Minuten und starten Sie ihn. Entfernen Sie nach dieser Zeit den Welpen und prüfen Sie, ob er nicht auf das Einklemmen der Hinterpfote reagiert.
3. Enthaupte den Welpen und sammle den Kopf in einer mit sACSF gefüllten Petrischale. Schneide die Haut entlang der Mittellinie ein, um den Schädel freizulegen.
4. Lokalisieren Sie die Öffnung im Schädel am Hinterhirn/Rückenmark und führen Sie ein Ende der Pinzette entlang des dorsalen Teils des Schädels ein. Fassen Sie den Schädel vorsichtig an der Mittellinie an und "schälen" Sie die Stücke seitlich ab, um das Gehirn freizulegen, und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu beschädigen.
5. Wenn du den dorsalen und lateralen Teil des Schädels entfernst, entferne das Gehirn vorsichtig mit der Pinzette oder dem Spatel aus dem Schädel, indem du unter die ventrale Oberfläche des Gehirns schaufst und versuchst, keinen Bereich zu beschädigen. Setzen Sie das Gehirn in eine andere Petrischale, die mit carboxygeniertem sACSF gefüllt ist. Anmerkung: Wir stellen zwei verschiedene Strategien vor, um den Hippocampus, das Striatum und den Kortex zu disparieren. Die erste Strategie (Schritte 2.1-2.10) ist für jede Mauslinie nützlich, während die zweite Strategie (Schritte 3.1-3.7) eine fluoreszierende Reportermaus benötigt, um das Striatum sauber vom Globus pallidus und anderen Gehirnstrukturen zu trennen. Wenn Striatum nicht erwünscht ist, ignorieren Sie die Striatum-spezifischen Teile der beiden Techniken

2. Ernte Striatum, Hippocampus und Cortex, Technik #1

1. Lege das ganze Gehirn mit der Bauchseite nach oben auf die Schnittmatrize. Platzieren Sie 1 Rasierklinge durch den vordersten Teil des Gehirns (durch den vorderen Riechtrakt).
2. Führen Sie eine weitere Rasierklinge direkt hinter der ersten ein, um eine 0,5 mm dicke Scheibe zu erzeugen, und platzieren Sie eine zusätzliche Rasierklinge hinter dieser.
3. Übertragen Sie diese Scheiben in eine Petrischale mit carboxygeniertem sACSF und legen Sie den Rest des Gehirns in eine separate Schale mit sACSF. Übertragen Sie die striatalen Schnitte in ein Präpariergerät, um das Striatum zu visualisieren. Diese Scheiben sollten große Teile des vorderen Striatums enthalten und keinen Hippocampus haben. Verwenden Sie ein fluoreszierendes Präparierfernrohr mit Nkx2.1-Cre^+/-; Ai9^+/- Scheiben zur Unterscheidung des schwachen striatalen tdTomato-Signals vom starken tdTomato-Signal des Globus pallidus.
4. Mit oder ohne Fluoreszenz das Striatum aus beiden Hemisphären an allen Abschnitten herausdrücken und striatale Brocken in ein ordnungsgemäß markiertes 50-ml-Röhrchen mit sACSF übertragen und auf Eis lagern.
5. Hemisectieren Sie das Gehirn entlang der Mittellinie mit einer Pinzette oder einer Rasierklinge und legen Sie die Hemisphäre so, dass die mediale Oberfläche nach oben zeigt.
6. Entfernen Sie das ventrale Hirngewebe (Thalamus, Basalganglien usw.), indem Sie dieses Gewebe mit einer Pinzette abkneifen. Wenn dies abgeschlossen ist, sollten der Hippocampus (eine wurstförmige Struktur, die die anteroposteriore Achse entlang des dorsalen Kortex überspannt) und die ventrikuläre Seite des Kortex deutlich sichtbar sein.
7. Um den Hippocampus zu entfernen, führen Sie die Spitzen der Pinzette vor den vorderen Hippocampus ein und trennen Sie den Hippocampus vorsichtig von der Rinde, indem Sie die Pinzette nach hinten bewegen und entlang der hippocampus-kortikalen Grenze einklemmen. Den isolierten Hippocampus in ein ordnungsgemäß markiertes 50-ml-Röhrchen mit sACSF überführen und auf Eis lagern.
8. Um den Kortex zu präparieren, legen Sie den halbierten Kortex mit der medialen Seite nach unten. Verwenden Sie dann die Pinzette, um die dorsalsten, ventralen, vorderen und hinteren Teile des Kortex einzuklemmen, um ein quadratisches Stück des medialen somatosensorischen Kortex zu hinterlassen, ~2 mm x 2 mm. Drehen Sie den Kortex so, dass die mediale Seite nach oben zeigt und reinigen Sie ihn bei Bedarf von überschüssigem nicht-kortikalem Gewebe (Thalamus, Basalganglien usw.) auf der medialen Oberfläche. Übertragen Sie den Cortex-Brocken in ein ordnungsgemäß beschriftetes 50-ml-Röhrchen mit sACSF und lagern Sie es auf Eis.
9. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Hemisphäre, um sowohl die Hippocampus- als auch die Kortexregion zu erfassen.
10. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Welpen und stellen Sie sicher, dass das sACSF zwischen den Welpen in den Petrischalen ausgetauscht wird, um sicherzustellen, dass das sACSF kalt und frisch bleibt.

3. Ernte Striatum, Hippocampus und Cortex, Technik #2

1. Lege die Bauchseite des Gehirns in eine mit Sylgard beschichtete Petrischale, die sACSF enthält, und stecke sie durch das Kleinhirn und die vordere Rinde oder den Riechkolben.
2. Beginnen Sie mit einer Hemisphäre und verwenden Sie eine gekrümmte Pinzette, um den hinteren Kortex sanft vom darunter liegenden Hippocampus und anderem Gewebe zu trennen. Legen Sie die geschälte Rinde vorsichtig flach auf die Petrischale. Wiederholen Sie dies für die andere Hemisphäre. Hippocampi und Striatum sollten im exponierten Gehirn deutlich sichtbar sein.
3. Drücke mit einer Pinzette einen Hippocampus an der Mittellinie ein und schäle den Hippocampus seitlich, um ihn zu entfernen. Legen Sie das Sammelfläschchen auf Eis und wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Hippocampus.
4. Für das Striatum kratzen Sie vorsichtig um die Ränder des Striatums herum, um es vom umgebenden Gewebe zu lösen. Entfernen Sie dann das Striatum, indem Sie es von unten abkneifen und geben Sie es in das Auffangröhrchen auf Eis. Wiederholen Sie dies für das andere Striatum.
5. Kortikale Abschnitte können wie in Schritt 2.8 beschrieben entnommen werden.
6. Bei Verwendung einer transgenen Reporter-Mauslinie (z. B. Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP usw.), das Striatum mit sACSF in eine Petrischale übertragen und unter einem fluoreszierenden Präparierfernrohr betrachten. Verwenden Sie eine Pinzette, um jegliches nicht-striatale Gewebe aus dem Striatum zu entfernen (in Nkx2.1-Cre; Ai9-Mäusen, entfernen sämtliches "helles" Gewebe, da Globus pallidus im Vergleich zu Striatum eine viel höhere mediale ganglionäre Eminenz oder MGE-abgeleitete tdTomato+-Zelldichte aufweist. Wiederholen Sie dies für alle Striatum.
7. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Welpen und stellen Sie sicher, dass das sACSF zwischen den Welpen in den Petrischalen ausgetauscht wird, um sicherzustellen, dass das sACSF kalt und frisch bleibt.

4. Erzeugung von Einzelzelldissoziationen

1. Nach Abschluss der Dissektion stellen Sie eine 1 mg/ml-Pronaselösung her, indem Sie 10 mg Pronase wiegen und in 10 mL carboxygeniertem sACSF auflösen.
2. Übertragen Sie das Gewebe aus den 50-ml-Sammelfläschchen in 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden, die 2 mL der Pronase-sACSF-Lösung enthalten. Inkubieren Sie das Gewebe 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und schütteln/schnippen Sie das Röhrchen während der Inkubation 3-4 Mal mit dem Finger, um die Proben zu mischen.
3. Bereiten Sie während dieser Inkubation eine Rekonstitutionslösung vor: 1 % fötales Rinderserum (FBS, 100 μl) + DNAse (1 μl von 1:10.000 Stamm-DNAse) in 10 ml carboxygeniertem sACSF.
4. Entfernen Sie nach den 20 Minuten vorsichtig die Pronaselösung, um das Gewebe am Boden nicht zu stören, und ersetzen Sie sie durch 1-2 ml der Rekonstitutionslösung (das Gesamtvolumen hängt von der Ausgangsmenge des Gewebes ab).
5. Dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch, indem Sie das Gewebe mit den zuvor vorbereiteten feuerpolierten Pasteur-Pipetten verreiben. Beginnen Sie mit der Pipette mit großer Bohrung (~600 μm) und aspirieren und stoßen Sie die Gewebelösung mindestens zehnmal aus, um das Gewebe aufzubrechen. Geben Sie keine Blasen in die Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Pipette mit mittlerer Bohrung und die Pipette mit kleinem Durchgang. Die Lösung sollte trüb sein und es sollte kein klares Stück Gewebe in den Entnahmeröhrchen sichtbar sein.
6. Pipettieren Sie die Zelllysatlösung durch einen 50-μm-Filter in konische 5-ml-Röhrchen, um Zellklumpen zu entfernen. Fahren Sie mit diesen Einzelzelllösungen mit der Durchflusszytometrie fort (oder möglicherweise direkt mit der Zellzählung, wenn keine Sortierung erforderlich ist).

5. Vorbereitung von fluoreszenzaktivierten Zellsortierlösungen (FACS)-gereinigten Zelllösungen für

1. die Transplantation Nachdem Sie die Zelllösungen aus dem Durchflusszytometer erhalten haben, geben Sie die Lösung in ein (oder mehrere) konische 1,5-ml-Röhrchen und drehen Sie die Zellen bei 500 g für 5 Minuten bei 4^°C. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Medium, so dass ~20-40 μL im Röhrchen verbleiben. Rekonstituieren Sie die Zellen in diesem verbleibenden Medium (und kombinieren Sie die Lösung, wenn mehrere Röhrchen benötigt wurden).
2. Mischen Sie auf einem kleinen Stück Parafilm 2 μl Zelllösung + 8 μl sACSF + 10 μl Trypanblau-Fleck. Pipettieren Sie 10 μl in ein Hämozytometer mit Objektträgerabdeckung.
3. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen in jedem der 4 x 4 quadratischen Gitter in den Ecken des Hämozytometers mit einem Standard-Labor-Handzählzähler (tote Zellen sind vom Farbstoff blau) und mitteln Sie diese 4 Zählungen. Multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, um die Anzahl der Zellen pro μl zu bestimmen.
4. Passen Sie bei Bedarf das Volumen so an, dass die Zellen eine Konzentration von 10.000-30.000 Zellen/μl in Rekonstitutionslösung haben. Die endgültige Konzentration hängt von der Gesamtmenge der Zellen und der gewünschten Anzahl von Transplantationen ab. Halten Sie die Zellen für die Transplantation auf Eis

6. Transplantation in P0-2 WT-Welpen

1. Wickeln Sie ein Wildtyp-Welpen (WT) in etwas Parafilm oder einen Handschuh und legen Sie es gut abgedeckt unter das Eis. Stellen Sie einen Timer auf 5 Minuten und starten Sie ihn. Entfernen Sie nach dieser Zeit den Welpen und prüfen Sie, ob er nicht auf das Einklemmen der Hinterpfote reagiert.
2. Während sich das Jungtier auf Eis befindet, mischen Sie die Zelllösung, indem Sie sie mehrmals pipettieren, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension vor dem Laden gut gemischt ist (mischen Sie die Zellen vor dem Laden der Mikropipette für jede Injektion). Entleeren Sie dann die Mikropipette des Mineralöls und füllen Sie diese vollständig mit der Zellsuspension.
3. Legen Sie den betäubten Welpen auf die Petrischale, wobei sein Kopf auf dem Klebekitt liegt, so dass die Oberseite des Kopfes relativ flach ist. Legen Sie das Klebeband mit dem Diamantloch quer über den Kopf des Welpen und ziehen Sie es straff, um sicherzustellen, dass die Haut gedehnt und der Kopf fest ist, die Maus aber bequem ist und gut atmet. Lambda sollte durch das Diamantloch sichtbar sein.
4. Schieben Sie den gesicherten Welpen unter das Nanoject und senken Sie die Mikropipette so ab, dass sich die Spitze der Mikropipette direkt über Lambda befindet. Notieren Sie die x-y-Koordinaten auf dem Manipulator.
5. Stellen Sie die Manipulatorknöpfe ein, um die Mikropipette entlang der mediolateralen und der anteroposterioren Achse des Kopfes auf die gewünschten Koordinaten zu bewegen: primärer somatosensorischer Kortex oder S1 Cortex → 1,0 mm anterior und 1,0 mm lateral, Hippocampus → 0,75-1,0 mm anterior und 1,0-1,2 mm lateral, Striatum → 2,0-2,2 mm anterior und 1,5 mm lateral. Die Koordinaten können leicht angepasst werden, um das Alter des Welpen (z. B. P0 vs. P2) oder den Stamm der Mäuse (z. B. CD1-Mäuse sind größer als und C57/B6 bei P2) auszugleichen.
6. Senken Sie die Mikropipette ab, bis sie eine kleine Konkavität auf der Haut bildet. Drehen Sie dann den Manipulatorknopf der Z-Achse fest, aber vorsichtig, um die Mikropipette durch die Haut und den Schädel in das Gehirn zu treiben. Wenn die Mikropipette in das Gehirn eintritt, wird der Druck auf den Schädel abgelassen und die Konkavität verschwindet.
7. Ziehen Sie die Mikropipette leicht zurück, bis die Spitze von einem Hautkegel umgeben ist, der wie ein Zelt geformt ist. Lesen Sie die Koordinaten entlang der z-Achsen ab: Dies ist der Nullpunkt der z-Achse.
8. Senken Sie die Mikropipette auf die gewünschte Tiefe ab: Cortex → 0,75-1,0 mm, Hippocampus → 1,2-1,5 mm, Striatum → 2,0-2,5 mm. Die Tiefe kann leicht angepasst werden, um das Alter oder die Belastung des Welpen auszugleichen.
9. Injizieren Sie die Zellsuspension mit dem oben beschriebenen Nanoject III-Programm. Warten Sie nach Abschluss des Injektionsprogramms 15-20 s, bevor Sie die Mikropipette langsam zurückziehen, um das Austreten der Lösung aus der Injektionsstelle zu minimieren.
10. Wenn Sie bilaterale Injektionen durchführen, stellen Sie die Mikropipette über Lambda wieder auf Null und bewegen Sie sich zu den richtigen Koordinaten in der anderen Hemisphäre. Alternativ kann man zwei Injektionen in die Hirnrinde derselben Hemisphäre vornehmen, indem man die Mikropipette 1 mm vor der ersten Injektion bewegt
.
11. Sobald die Transplantation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Klebeband und übertragen Sie den Welpen auf das Heizkissen. Markieren Sie den Welpen bei Bedarf mit dem Schwanz- oder Zehenschnitt. Sobald der Welpe wieder eine rote Farbe angenommen hat und sich bewegt, setzen Sie ihn zurück in den Käfig zu der Mutter.

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