Elektroporations-vermittelte Transfektion von Spinalganglien der Maus zur Förderung der revitalisierten Axon

Zusammenfassung

Quelle: Li, Q. et al. Untersuchung der Axonregeneration von Säugetieren: In vivo Elektroporation des Spinalwurzelganglion einer adulten Maus. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Elektroporations-vermittelte Transfektion von DRG-Neuronen der Maus zur Untersuchung der Axonregeneration. Es beschreibt die Schritte zur Verabreichung von Nukleinsäurekonstrukten an DRG-Neuronen, zur Induktion von Ischiasnervenverletzungen und zur Beurteilung der axonalen Regeneration.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Dorsales Wurzelganglion (DRG) Injektion
   1. Injizieren Sie intraperitoneal eine Anästhesielösung (verdünnen Sie Avertin in steriler Kochsalzlösung bei einer Endkonzentration von 20 mg/ml, mit Avertin 200 mg/kg Körpergewicht), um die Anästhesie vor der DRG-Injektion aufrechtzuerhalten.
   2. Laden Sie die Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Plasmide oder Ribonukleinsäure (RNA)-Oligos (1 μl pro DRG) in die Glaskapillarpipette.
   3. Führen Sie die Spitze der Kapillarglaspipette vorsichtig in die DRG ein.
   4. Injizieren Sie nach und nach 1,0 μl Lösung von DNA-Plasmiden oder RNA-Oligos in das DRG mit den intrazellulären Mikroinjektions-Dosiersystemen (30 psi, 8 ms).
      HINWEIS: Die Dauer der Injektion sollte nicht weniger als 5 Minuten betragen.
2. Elektroporation
   1. Tropfen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf die Spitzen der Elektroden.
   2. Reinigen Sie die Blutung mit sterilisierter quadratischer Baumwollgaze.
   3. Kneifen Sie das Ziel-DRG vorsichtig mit den Elektroden zusammen und legen Sie 5 quadratische elektrische Impulse mit dem Elektroporationssystem an.
   4. Verschließen Sie die Muskel- und Hautschichten mit 5-0 Nylonnähten.
   5. Legen Sie die Maus unter strenger Beobachtung auf eine beheizte Decke (35,0 °C), bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Bringen Sie die Maus wieder in den Käfig zurück, nachdem sie sich vollständig von der Anästhesie erholt hat.
      HINWEIS: Es dauert ca. 60 Minuten, bis sich die Maus vollständig von der Narkose auf der 37 °C warmen Decke erholt hat. Lösen Sie eine Tablette (200 mg) Ibuprofen in 1.000 ml Wasser (0,2 mg/ml) für die tägliche Fütterung auf, um die postoperativen Schmerzen zu lindern.
3. Ischiasnervenquetschung
   1. Zwei oder drei Tage (je nach Versuchsdesign) nach der DRG-Elektroporation die Maus intraperitoneal mit der Anästhesielösung (mit Avertin 400 mg/kg Körpergewicht) anästhesieren.
   2. Klebe die vier Gliedmaßen der Maus auf die Pinnwand.
   3. Machen Sie einen 1 cm großen Schnitt 0,5 cm nach links entlang der Mittellinie. Schneiden Sie die Muskeln, wie z. B. den Musculus gluteus maximus und den Musculus piriformis, in Längsrichtung ab. Legen Sie das Segment des Ischiasnervs zwischen dem Foramen ischiasis major und der Ischiaskerbe frei.
   4. Quetschen Sie den Nerv mit einer mikrochirurgischen Pinzette für 12 s und markieren Sie die Quetschstelle mit einer 10-0 Nylon-Epineuralnaht. Machen Sie einen Knoten auf der Duralmembran, um die Quetschstelle zu markieren.
   5. Verschließen Sie die Muskel- und Hautschichten mit einer 5-0 Nylonnaht.
   6. Legen Sie die Maus mit großer Aufmerksamkeit auf eine beheizte Decke (35,0 °C), bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustrolle aufrecht zu erhalten. Bringen Sie die Maus wieder in den Käfig zurück, nachdem sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
      HINWEIS: Es dauert ungefähr 60 Minuten, bis sich die Maus vollständig von der Narkose auf der 37 °C warmen Decke erholt hat. Lösen Sie eine Tablette (200 mg) Ibuprofen in 1.000 ml Wasser (0,2 mg/ml) für die tägliche Fütterung auf, um die postoperativen Schmerzen zu lindern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ECM 830 Rechteck-Elektroporationssystem	BTX Harvard Apparatus	45-0052	Für die in vivo Elektroporation
Pinzettenelektroden	BTX Harvard Apparatus	45-0524	Für in vivo Elektroporation, 1 mm flach
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intrazelluläre Mikroinjektions-Dosiersysteme
Kapillaren aus Borosilikatglas	World Precision Instruments, Inc.
Stereo-Dissektionsmikroskop	Leica	M80
Mikrochirurgie Pinzette	FST von DUMONT, Schweiz	11255-20	Nur für Ischiasnervenquetschung
Glas Kapillare	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, Standard
Wandband	Fisherbrand	15-901-30	Zur Befestigung der Maus auf der Pinnwand
2, 2, 2-Tribromethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin Stammlösung
2-Methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin Stammlösung
siRNA Fluoreszierend Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-Target-siRNA mit Fluoreszenz-microRNA
Mimic Transfection Control mit Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-Target-microRNA mit
	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-kodierende Plasmidpräparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	Zur besseren Visualisierung des DRG-Umrisses während der Injektion
Ketamin	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anästhesieeinleitung
Xylazin	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anästhesieeinleitung
Paracetamol	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Postoperative Schmerzlinderung

1902328Fluoreszenz-Plasmid-Präparationskit