Quantifizierung dendritischer Dornen mittels konfokaler Mikroskopie

Abstract

Quelle: Gouder, et. al. Dreidimensionale Quantifizierung von dendritischen Dornen aus pyramidalen Neuronen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video zeigt die Bildgebung und Analyse von dendritischen Dornen in transduzierten, immunmarkierten Pyramidenneuronen mittels konfokaler Mikroskopie. Hintergrundgeräusche werden reduziert und Dendriten werden durch Schätzung ihres Durchmessers und ihrer Länge verfolgt. Die automatisierte Segmentierung der Wirbelsäule umfasst die Einstellung von Parametern für die Abmessungen von Dendriten und Wirbelsäulen und die Klassifizierung von Wirbelsäulen. Ein 3D-Modell wird generiert und zur Analyse exportiert.

Protocol

1. Neuronale Kultur

1. Behandeln Sie 6-Well-Kulturplatten mit Glasdeckgläsern mit Poly-Ornithin (verdünnt auf 1/6 in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), Stammkonzentration 0,01 %) über Nacht (O/N), gefolgt von drei Waschgängen in DPBS. Geben Sie dann Laminin (Stammkonzentration 1 mg/ml, 500-fach in DPBS verdünnt) für mindestens 10 Stunden unter die Durchflusshaube
.
2. Platte und Versand von neuralen Stammzellen (NSC) mit geringer Dichte (50.000 Zellen/cm2) in 6-Well-Kulturplatten mit Glasdeckgläsern in 3 ml Kulturmedium, bestehend aus Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nährstoffmischung F-12 oder DMEM/F12 (500 ml), 2 Fläschchen (je 5 ml) N2-Supplement, 2 Fläschchen (je 10 ml) B27-Supplement, 10 ml Pen-Streptomycin (Penicillin = 10.000 Einheiten/ml und Streptomycin = 10.000 Einheiten/ml), 1 ml 2-Mercaptoethanol (Stammlösung: 50 mM) und Laminin (1/500), ohne Wachstumsfaktoren.
   KRITISCHER SCHRITT: Führen Sie diesen Schritt vorsichtig durch, indem Sie Zellen mit langsam rotierenden Bewegungen hinzufügen, um die Zellansammlungen zu reduzieren.
3. Entfernen Sie das Nährmedium. Geben Sie frisches N2B27-Medium mit 2 μg/ml frischer Lamininlösung hinzu, um das Neuron auf den Glasdeckgläsern zu halten und ein Verklumpen zu vermeiden. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage. Bewahren Sie einen Teil des restlichen Mediums (200 μl) auf, bevor Sie frisches Medium hinzufügen, um ein Austrocknen der Zelle zu verhindern. Alternativ können Sie schnell vorgehen und das Gesamtvolumen (3 ml) ändern.

2. Lentivirale Transduktion

Hinweis: Die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wird durch den Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor der Maus gesteuert. Für diese Studie betrug der Virustiter 400 ng/μl (Stammlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1x).

1. Humane induzierte pluripotente Stammzellen oder iPSC-abgeleitete Neuronen werden in jedem Reifungsschritt durch Viruspartikel transduziert, indem 1 μl der Stammlösung mit 40 ng GFP-lentiviralem Vektor pro Kulturvertiefung (6-Well-Platten) hinzugefügt und 48 Stunden lang in frischem Kulturmedium inkubiert wird. Hinweis: Bei diesem Protokoll ermöglicht die Inkubationsdauer eine gute Markierung der Wirbelsäulenstrukturen.

3. Immunfluoreszenz

Hinweis: Um die Markierung der gesamten Wirbelsäulenmorphologie zu verbessern, wurde die Immunfluoreszenzmarkierung mit einem Anti-GFP-Antikörper unter permeabilisierten Bedingungen durchgeführt.

1. Das Kulturmedium entfernen und die transduzierten Zellen 10 min lang bei Raumtemperatur oder RT in 4 % Paraformaldehyd auf Deckgläsern fixieren, dann 3 Mal in 1x PBS (je 10 min) waschen.
2. Tauchen Sie die Deckgläser 1 Stunde lang bei RT in PBS, ergänzt mit 0,05 % Triton (100x) und 10 % Pferdeserum, und waschen Sie sie dann 3 Mal in 1x PBS.
3. 100 μl 1x PBS, ergänzt mit 4 % Pferdeserum und Primärantikörper (1/1.000), aufgezogen gegen GFP und verdünnt um den Faktor 1.000, auf jedem Deckglas zugeben. In einer dunklen Box O/N bei 4°C inkubieren, dann 3 Mal mit 1x PBS waschen.
4. Verdünnen Sie den Alexa Fluor 488-konjugierten Antikörper (1/200) in PBS, ergänzt mit 0,5 % Tween 20, und inkubieren Sie ihn 1 Stunde lang bei RT. Anschließend 3 Mal in 1x PBS waschen und Deckgläser mit einem Eindeckmedium für die Fluoreszenzmikroskopie auf Objektträger aufkleben.

4. Bildgebung der dendritischen Wirbelsäule

1. Führen Sie eine konfokale Bildgebung durch ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop durch.
2. Wählen Sie gesunde Neuronen mit pyramidaler Morphologie und einer vollständigen dendritischen Arborisierung aus und quantifizieren Sie mindestens 10 Neuronen pro Bedingung aus separaten Experimenten. Quantifizieren Sie 60 - 100 μm pro Dendriten.
3. Nehmen Sie Bilder mit einem 40-fachen Öl-NA = 1,3-Objektiv und einer 488-nm-Laserlinie für die GFP-Anregung auf, mit einer typischen Spitzenleistung auf Probenebene von etwa 20 μW. Stellen Sie die Pixelgröße auf etwa 80 nm ein, um dendritische Stacheln korrekt abzutasten.
   Hinweis: Die anschließende Analyse erfordert ein Bild, in dem das Rauschen die korrekte Segmentierung von Dendriten und Stacheln nicht beeinträchtigt. Mit den oben genannten Einstellungen für räumliches Sampling und Leistung haben wir festgestellt, dass eine Pixelverweilzeit von 3,15 μs ausreicht, um genügend Photonen zu sammeln, um ein solches Bild zu erstellen. Bei dunklen Proben kann die Bildqualität durch den Durchschnitt von 2 bis 4 Scans verbessert werden. Möglicherweise ist die Erfassung mehrerer XY-Kacheln erforderlich, um den interessierenden Bereich abzudecken, der dann vor der Verarbeitung zusammengenäht werden muss.
4. Um das gesamte Neuronenvolumen abzutasten, erfassen Sie einen Z-Stapel mit einem Z-Abstand von 150 nm bis 300 nm, was 20 bis 30 Z-Schichten ergibt.
   Hinweis: Die mit diesen Einstellungen erreichte laterale räumliche Auflösung beträgt 234 nm und die axiale Auflösung 591 nm. Die hier gewählte Probenahme ist ausreichend, aber da die axiale Auflösung größer ist als die kleinste Größe der abzubildenden Stacheln, begünstigt die Analyse die Stacheln, die sich lateral von den Dendriten erstrecken.

5. 3D Quantifizierung dendritischer Dornen

Hinweis: In den folgenden Abschnitten wird speziell die Verwendung der Imaris-Software für die Analyse beschrieben. Es gibt alternative Implementierungen, darunter NeuronStudio oder Metamorph, die ähnliche Ergebnisse liefern können.

Verwenden Sie die folgenden wichtigen Einstellungen:

1. Als Vorverarbeitungsstufe wird die Gaußsche Filterung über die von der Software angebotenen Bildverarbeitungsfunktionen verwendet. Führen Sie die Gaußsche Filterung über die Bildverarbeitung > Glättung > Gaußschen Filter durch. Legen Sie die Filterbreite so fest, dass sie der Pixelgröße in XY entspricht.
2. Führen Sie eine halbautomatische Verfolgung von Dendriten mit dem Filament Tracer-Modul der Software durch.
   1. Zuerst schätzen Sie den Dendritendurchmesser mit dem Abstandswerkzeug im Scheiben-Tab der Software.
   2. Klicken Sie auf der Registerkarte "Übertreffen" auf das Werkzeug "Filamente". Für eine bessere Robustheit stützt sich dieses Protokoll auf halbautomatisches Tracking. Klicken Sie auf Automatische Erstellung überspringen. Auf der Moduloberfläche wird jetzt die Registerkarte Zeichnen angezeigt. Wählen Sie hier AutoPath als Methode und Dendrit als Typ aus, und geben Sie den geschätzten Dendritendurchmesser ein.
   3. Verwenden Sie den Auswahlmodus des Mauszeigers, um den Cursor in ein Feld zu verwandeln. Klicken Sie mit gedrückter Umschalttaste mit der rechten Maustaste auf den Dendriten-Startpunkt. Hinweis: Die Software führt erste Berechnungen durch.
   4. Bewegen Sie den Mauszeiger entlang des Dendriten. Vom Startpunkt aus (dargestellt als blaue Kugel) wird eine gelbe Linie angezeigt, die den wahrscheinlichsten Dendritenpfad darstellt. Klicken Sie bei gedrückter Umschalttaste mit der linken Maustaste auf den Dendritenendpunkt.
3. Führen Sie die automatische Segmentierung der Buchrücken durch. Hinweis: Die Stacheln auf dem verfolgten Dendriten werden von der Modulschnittstelle automatisch gefunden.
   1. Klicken Sie in der Moduloberfläche auf die Registerkarte Erstellung. Wählen Sie in der Dropdown-Liste Rebuild die Option Rebuild Dendrite Diameter aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Daten beibehalten. Klicken Sie dann auf Neu erstellen.
   2. Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass das segmentierte Volumen dem tatsächlichen Dendritenvolumen entspricht. Wählen Sie als Algorithmus die kürzeste Entfernung aus der Entfernungskarte aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter.
   3. Bestimmen Sie den kleinsten Durchmesser des Wirbelsäulenkopfes und die maximale Länge, indem Sie erneut das Abstandswerkzeug auf der Registerkarte "Slice" der Software verwenden, kehren Sie dann zur Registerkarte "Surpass" zurück und geben Sie die Parameter ein. Für dieses Protokoll sind Werte um 200 - 300 nm für minimalen Durchmesser und 4 μm für maximale Länge gute Ausgangspunkte. Aktivieren Sie nicht das Kontrollkästchen Verzweigungsdrehungen zulassen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter.
   4. Passen Sie den Schwellenwert für Kernpunkte so an, dass die blauen Punkte, die die Wirbelsäulen darstellen, auf die tatsächlichen Wirbelsäulenköpfe lokalisiert werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter. Hinweis: Die Kernberechnung ist nun abgeschlossen und kann langwierig sein.
4. Klassifizieren Sie Spines, indem Sie auf die Registerkarte Tools der Moduloberfläche gehen. Klicken Sie auf Stacheln klassifizieren. Stellen Sie in der Eingabeaufforderung sicher, dass es vier Klassen gibt, die durch ihre Morphologie wie folgt definiert sind: Stubby: Länge <1 μm; Pilz: Länge (Wirbelsäule) >3 und maximale Breite (Kopf) > mittlere Breite (Hals) x 2; Lang dünn: Mittlere Breite (Kopf) ≥ Mittlere Breite (Hals); Filopodienähnlich: Länge ≤ 4 μm (kein Kopf). Hinweis: Die Modulschnittstelle generiert vier neue Filament-Objekte, die die Ergebnisse der Klassifizierung enthalten.
5. Statistische Daten exportieren: Gehen Sie auf einer dieser vier Objektschnittstellen auf die Registerkarte Statistiken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle Statistiken in Datei exportieren.
   Hinweis: Andere statistische Werte können für Dendriten (z. B. Länge, Fläche, mittlerer Durchmesser, Asttiefe, Verzweigungswinkel, Volumen usw.) und Stacheln (z. B. Geradheit, Ansatzbereich, Länge und Volumen verschiedener Stachelteile, Spine-Durchmesser, Dichten, etc.).

Materials