Intrathekale Verabreichung von Viren in einem Mausmodell zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralnervensystems

Zusammenfassung

Quelle: Li, D., et al. Direkte intrathekale Injektion von rekombinanten Adeno-assoziierten Viren in erwachsene Mäuse. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur intrathekalen Injektion von Adeno-assoziierten Viren (AAV) in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) einer wachen Maus, einschließlich der Spritzenvorbereitung, der Ausrichtung der Wirbelsäule und des präzisen Einführens der Nadel. Diese Methode validiert die gezielte Verabreichung von Genen und unterstützt ihr Potenzial für ZNS-Therapien.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Herstellung von 20% iger Lidocainhydrochlorid-Stammlösung

1. Wiegen Sie 2 g Lidocainhydrochlorid. 5–6 ml steriles Wasser hinzufügen und vorsichtig vortexen. Erhöhen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf 10 mL.
2. 1.2 Die Stammlösung durch 0,2-Mikron-Filter filtrieren. Aliquotieren Sie die Stammlösung, 1 mL pro 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, und versiegeln Sie sie mit einer Siegelfolie. Bei 4 °C lagern.

2. Direkte intrathekale AAV-Verabreichung bei wachen Mäusen

1. Wischen Sie den Arbeitsbereich mit steriler Gaze mit 70%igem Ethanol ab und bereiten Sie die erforderlichen Vorräte vor.
2. Bereiten Sie 100 μl AAVrh.10/1%ige Lidocainhydrochlorid-Komplex vor, indem Sie 95 μl rAAVrh10-Stammlösung (5 x 10¹² Genomkopien/ml) in ein steriles 200-μl-Mikrozentrifugenröhrchen geben und 5 μl 20%ige Lidocainhydrochlorid-Stammlösung hinzufügen. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. Lagern Sie dann die Viruslösung auf Eis (4 °C).
   HINWEIS: Es werden 8 μl pro Maus verwendet.
3. Vorbereiten der Spritze mit AAV-Lösung für die Injektion
   1. Montieren Sie eine 25-μl-Hamilton-Spritze mit einer 27-G-Nadel und richten Sie die abgeschrägte Spitze der Nadel an der volumetrischen Skala auf der Spritze aus.
   2. 8 μL mit 4 x 10¹⁰ Genomkopien der Viruslösung vorsichtig in die Spritze ziehen. Achten Sie darauf, Luftblasen zu entfernen.
4. Vorbereitung der Maus
   HINWEIS: In dieser Studie wurden männliche oder weibliche FVB/NJ-Mäuse (30–70 Tage alt) verwendet. Die IT-Injektion wurde in der Haube durchgeführt.
   1. Sterilisieren Sie den Arbeitsbereich in einer Haube mit 70% Ethanol. Legen Sie die wache Maus (männlich oder weiblich, 30–70 Tage alt, 13–20 g Gewicht) in Bauchlage in der Kapuze auf ein Bettstück. Decken Sie den Oberkörper mit steriler Gaze ab, um die Maus zu beruhigen und zu vermeiden, gebissen zu werden.
   2. Fixieren Sie das Tier, indem Sie es mit dem Daumen auf der einen Seite und dem Zeigefinger/Mittelfinger auf der anderen Seite richtig und fest am Beckengürtel greifen. Halten Sie die Haut zwischen den beidseitigen Beckengürteln mit Daumen und Zeigefinger straff. Halten Sie das Tier mit der Handfläche sanft am Oberkörper fest.
   3. Rasieren Sie das Fell auf dem Rücken zwischen den beidseitigen Beckengürteln und sterilisieren Sie dann die Hautoberfläche mit einem Peeling auf Jodidbasis und 70% Ethanol.
5. Intrathekale Injektion
   1. Fühlen Sie mit dem Daumen oder Zeigefinger der anderen Hand den Zwischenwirbelraum entlang der Mittellinie zwischen den beidseitigen Beckengürteln und drücken Sie mit einem Fingernagel auf eine Vertiefung, um den Zwischenwirbelraum L5-L6 anzuzeigen (lokalisieren Sie die Injektionsstelle).
   2. Drehen Sie die Basis des Schwanzes leicht und sanft, um die Mittellinie der Wirbelsäule anzuzeigen. Stellen Sie die Nadelschräge vor der Injektion in Richtung des Kopfes des Tieres ein.
   3. Stellen Sie sicher, dass die Tiere fest fixiert sind, und richten Sie die Nadel entlang der Mittellinie der Wirbelsäule aus.
   4. Führen Sie die Nadel vorsichtig und senkrecht (oder leicht um 70–80° neigend) in den Schnittpunkt der Vertiefung ein und halten Sie die Spritze in einer zentralen Sagittalebene. Reduzieren Sie den Winkel langsam auf ca. 30°, wenn er den Knochen verbindet, und schieben Sie dann die Nadel in den Zwischenwirbelraum.
      HINWEIS: Ein offensichtliches plötzliches Schwanzschlagen ist ein Zeichen für den erfolgreichen Eintritt in den intraduralen Raum. Sobald die Nadel in den Zwischenwirbelraum eintritt, fühlt sich die Nadelspitze fest geklemmt an. Die in dieser Studie verwendete 27-G-Nadel ist für die IT-Verabreichung bei Mäusen, aber nicht bei Ratten geeignet.
   5. Injizieren Sie die Vektorlösung. Starten Sie den Timer und injizieren Sie 8 μl der Vektorlösung mit einer Geschwindigkeit von 1 μL/4 s. Halten Sie die Nadel etwa 1 Minute nach Beendigung der Verabreichung fest. Ziehen Sie die Nadel mit sanfter Drehung zurück, um ein Auslaufen zu vermeiden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
FVB/NJ Mäuse	Charles River Laboratories China
Lidocain-Hydrochlorid-Monohydrat	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core des Gentherapiezentrums an der Universität von Massachusetts Medical School
25μL Hamilton Spritze/27-30g Nadel	GASTIGHT	1702
70% Ethanol	WEN ZHI
Gaze	Wei AN 5171112		8cm*10cm*12cm