Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Summary

Eine Methode, um translationsaktiven, intakte Synaptoneurosomen (SNS) von der Maus Hirnrinde vorbereiten beschrieben. Das Verfahren nutzt eine diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Dichtegradienten Dies ermöglicht die schnelle Erstellung von aktiven SNS.

Abstract

Synaptoneurosomen (SNS) sind nach der Homogenisierung und Fraktionierung von Maus Hirnrinde erhalten. Sie sind Vesikel oder isolierte Terminals, die ausbrechen aus Axonterminalen wenn die kortikale Gewebe wird homogenisiert und verschließen. Die SNS behält prä-und postsynaptischen Eigenschaften, wodurch sie sinnvoll in das Studium der synaptischen Übertragung. Sie behalten die molekulare Maschinerie in neuronalen Signalübertragung verwendet und sind in der Lage die Aufnahme, Speicherung und Freisetzung von Neurotransmittern.

Die Herstellung und Isolierung von aktiven SNs kann problematisch mit Medien wie Ficoll, die zytotoxisch können und müssen verlängert Zentrifugation aufgrund der hohen Dichte und Filtration und Zentrifugation Methoden, die in geringer Aktivität durch eine mechanische Beschädigung der SNS können die Folge sein. Allerdings ist die Verwendung von diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten an SNS isolieren eine schnelle Methode, um gute Ausbeuten an translationsaktiven SNs produzieren. Die Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode ist schnell und sanft wie es isotonischen Bedingungen beschäftigt, hat weniger und kürzere Zentrifugation Spins und vermeidet Zentrifugationsschritte, dass Pellet SNs und mechanische Schäden verursachen.

Protocol

1. Die Vorbereitungen ^1-4

1. Bereiten Sie 500 mL Gradienten-Medium (GM)-Puffer durch Mischen von 50 mL einer 2,5 M Saccharose Gülle, 2,5 mL einer 1M Tris-HCl, pH 7,5 Lager, und 0,1 ml einer 0,5 m EDTA, pH 8,0 Lager mit Milli- Q-Wasser, um die Lautstärke. Filter sterilisieren die Lösung, Aliquot und speichern eingefroren.
2. Bereiten Sie eine 1000x Lager von Tetrodotoxin (TTX), indem Sie eine 1 mM Lösung in Milli-Q-H ₂ O. Aliquots der TTX kann bei -20 ° C gelagert werden
3. Bereiten 10x Stimulation Buffer, indem eine Lösung von 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na ₂ HPO _4, 4 mM KH ₂ PO _4, 40 mM NaHCO _3, und 800 mM NaCl in Milli-Q-Wasser. Lager kann bei 4 ° C gelagert werden
4. Pre-cool-Zentrifugen auf 4 ° C.
5. Bereiten Sie eine Stammlösung von isosmotischen Percoll (SIP) durch Zugabe von 9 Volumina Percoll (18 ml) zu 1 Volumen von 2,5 M Saccharose (2 mL) in Milli-Q-Wasser und gut mischen.
6. Bereiten Sie die 3, 10, 15, und 23% Steigung Schichten, indem die jeweiligen Mengen von SIP auf GM-Puffer und Mischen jeder:

7. Gießen Gradientenschichten durch Pipettieren 2 ml jeder der 23, 15, 10, und 3% isosmotischen Percoll-Lösungen in den Beckman Zentrifugenröhrchen mit Kappen mit einem P1000 Gilson Pipetman. Die Schnittstelle zwischen den Schichten sollten klar erkennbar ohne Vermischung der Schichten. Bewahren Sie die Gradienten bei 4 ° C für mindestens 20 min vor dem Gebrauch. Die Gradienten können bis zu 24 Stunden gelagert werden, obwohl am gleichen Tag verwenden wird empfohlen. [Unerfahrene Laborpersonal kann bereitet Gradienten, indem blauen Farbstoff der isomotic Percoll-Lösungen für die Visualisierung der Schicht Schnittstellen der Praxis.]

2. Maus Dissektion ¹

1. Stellen Sie sicher, dass alle Maus Tierhaltung und Euthanasie Verfahren im Einklang mit NIH und der Universität Richtlinien durchgeführt werden. Euthanize Welpen (Alter P13 bis P21) durch Kohlendioxid Ersticken oder durch ein Verfahren genehmigt der in der Tier-Protokoll.
2. Pin mit der Maus ein Dissektion Bord und besprühen Sie die Rückseite des Halses und des Kopfes mit Ethanol. Mit einer scharfen Schere durch das Rückenmark an der Basis des Schädels schneiden, entfernen Sie die Haut von der Oberseite des Schädels, schneiden Sie den Schädel seitlich zwischen dem Scheitelbein und der interparietalen Knochen oder zwischen dem Großhirn und dem Cortex Regionen. Dann schneiden Sie den Schädel von der Basis an der Nase (entlang der sagittalen Naht), entfernen Sie vorsichtig den weichen Scheitelbein, indem jeder Hemisphäre auf die Seite und entfernen Sie die Rinde mit einem Spatel. Legen Sie den Spatel in das Gehirn über das Kleinhirn und dann schaufelt aus dem Cortex und legen Sie sie in eiskaltem GM-Puffer. Gehen Sie sofort auf die Homogenisierung Schritt. Lassen Sie sich nicht den Kortex sitzen in eiskaltem Puffer für sehr lange, da dies sich negativ auf die Bildung von SNS.

3. Vorbereitung von Homogenat und SNS ^1-4

1. Spülen Sie den Kortex in eiskaltem GM-Puffer und übertragen zwei Kortex, ein Glas Dounce Homogenisator mit 5 ml kaltem GM-Puffer.
2. Vorsichtig homogenisiert den Kortex mit 5-10 Schläge des losen Pistill (Stößel "A"), um 5-10 Schläge der engen Pistill (Stößel "B") folgten. Strokes sollte schnell, aber langsam genug, um nicht Luftblasen verursachen. Ein Bild von dem Homogenat nach der Homogenisierung ist in Schema 1. Die Anzahl der Schläge variiert abhängig von der individuellen Homogenisator und begleitende Stößel. Wenn Sie fertig sind die Gradienten sollte eine starke SN Band geben, wenn nicht, stellen Sie die Anzahl der Schläge.
3. Übertragen Sie die Homogenat in ein 15 ml konische und Zentrifuge bei 1000xg für 10 min bei 4 ° C in einem Ausschwingrotor (Allegra 6KR Zentrifuge) zum Pellet Zelltrümmer und Zellkerne. Ein Bild des gesponnenen Homogenat wird in Schema 1.
4. Layer 2 mL des Überstandes pro Percoll-Saccharose-Gradienten, Kappe der Rohre und Zentrifuge bei 32.500 xg für 5 min bei 4 ° C in einem Festwinkelrotor (Beckman J2-21 Zentrifuge, JA-17 Rotor) mit entsprechenden Adaptern ( Siehe Reagenzien und Tabelle).
5. Pipette ab und entsorgen Sie die Lösung über dem SN-Band mit einem Glas Pasteur Pipette. Pipette aus der SN-Band auf der 15/23%-Schnittstelle, um einen konischen und speichere sie auf Eis zu übertragen. Jede Steigung oder eine Rinde produziert 0,9-1,1 mL SN.
6. Passen Sie die Salzkonzentration des SNS durch Zugabe von einem Zehntel Volumen von 10x Stimulation Puffer, fügen 1000x CaCl ₂ zu einer Endkonzentration von 12 nM, und fügen Sie 1 mM TTX Lager, um eine endgültige Konzentration von 1 nM, um unspezifische Erregung zu unterdrücken. (Zusatz von CaCl ₂ ist optional, wenn sie mit nachgeschalteten SN-Anwendungen stören).
7. Bestimmen der Proteinkonzentration der SNS mit dem Micro BCA Protein Assay Kit. (The Bradford-Protein-Assay ist nicht, weil der Schluß von der Percoll empfohlen.)
8. SNs können direkt und schnell für Protein-Übersetzungen verwendet werdenTION Studien. Für andere Anwendungen SN Lysat kann bereinigt werden oder konzentriert mit dem Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Wenn Maus Cortex homogenisiert wurde und diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten (Schema 1), 6 Bands oder Fraktionen getrennt gesehen wurden (Abbildung 1). Es war zuvor für Ratten gezeigt Großhirnrinde ^3,5, dass die Bestandteile der hochmolekularen Bands Membran und Myelin gebrochen wurden und dass die pelletierte Material enthaltenen Mitochondrien oder Organellen (Tabelle 1). Die 23% / 15%-Schnittstelle (Band 5) enthalten die angereicherten SNS.

Die Bande bei 23% / 15%-Schnittstelle, mit intakten SNs, wurde entfernt und durch Elektronenmikroskopie (EM) wie zuvor beschrieben untersucht. ^2,6 EM das Vorhandensein von intakten synaptischen Vesikeln und die Erhaltung der präsynaptischen und postsynaptischen Elementen (Abbildung gezeigt 2). Isolierung von prä-und postsynaptischen Kompartimente für die Prüfung Signal-und Proteinsynthese, die in beiden Kammern tritt wichtig. ^7-13 Die Percoll-Saccharose-Gradienten ist eine grobe Reinigung, so dass wir kleinere Zellen, Kern-und Organell Kontamination sah in der SN-Fraktion, aber die Gesamt-Trennung war gut.

Wenn mittels Western Blot untersucht, enthielt die Percoll Fraktionen die erwarteten Protein-Marker mit einer Erhöhung der synaptischen Reinheit in der SN-Band (Abbildung 3, Tabelle 2). Synaptic und neuronalen Marker wurden in den angereicherten SN-Band (Band 5) beibehalten, aber die Fülle von anderen Markern deutlich reduziert werden. Insbesondere wurden die Anwesenheit von GFAP, ein Marker für Astrozyten und neoplastischen Zellen glialen Ursprungs, und Lamin-B1, eine nukleare Marker, vernachlässigbar, während strukturelle und synaptischen Marker wurden beibehalten oder ausgebaut. Darüber hinaus gab es Aufbewahrung von Markern für Organellen, wie Mitochondrien und Golgi, die eine Rolle spielen bei der Proteinsynthese.

Typische Ausbeuten für die SN-Band wurden 250-500 ng Protein pro Mikroliter, wie BCA Protein Assay bestimmt. Die Aktivität des SNS wurde von der Menge des de novo Protein-Synthese ermittelt derzeit, wie überwacht werden [35S]-Met Aufnahme (Abbildung 4). ² Basal translationale Aktivitäten betrug 1,56 fache erhöht, wenn SNs mit 50 uM glutamate/10 uM Glycin stimuliert wurden (Glu) oder 5.12 fache an, wenn mit der Pin1-Hemmer Juglon aktiviert. Pin1-Inhibition ist bekannt, dass eine erhöhte Proteinsynthese. ² Resultat zu bestätigen, dass die Zunahme von [35S]-Met Einarbeitung durch de novo Proteinsynthese war, haben wir 40 uM Anisomycin, ein Protein-Synthese-Hemmer, und sah eine deutliche Abnahme der Inkorporation in Anwesenheit und Abwesenheit von Glu, wenn die Basis-Ebenen verglichen. Auch bei der Zugabe von 2% Triton-X 100, die die Integrität des SNS stört, wurde basal Übersetzung um 75% gesunken. ^{2 Darüber} hinaus bei der Prüfung der Bänder (B4-B6), dass die meisten synaptischen Marker Bereicherung zeigten, die SNS oder Band 5 war die größte Aktivität für de novo Protein-Synthese (Abbildung 5). So der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten schnell einen hoch aktiven und bereichert SN Band, die verwendet werden, um Protein-Übersetzung Studie werden können.

Die diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Gradienten Verfahren ist vorteilhafter als andere Methoden, weil mechanische Schäden, die durch härteren Bedingungen verursacht wird. Wenn die Filtration Methode, bei der kortikalen Homogenat gelöscht verglichen wird durch eine Reihe von Filtern, die Abnahme der Größe, Form ^3,14-15 die Percoll-Methode mehr SNs mit größerer Aktivität vergangen. Wie in Abbildung 6, wenn ein Aliquot SNs durch die Filtration Methode hergestellt über einen Percoll-Saccharose-Gradienten gibt es weit weniger SNs am 15/23%-Schnittstelle und eine größere Menge von gebrochenen Membranen verabschiedet wurde gesehen. Wenn de novo Proteinsynthese über S35-met Aufnahme gemessen wurde, waren die SNS durch die Filtration Methode hergestellt weit weniger aktiv ist (Abbildung 7). Zur Maximierung der translationalen Aktivität verwenden wir Mäuse, die im Alter zwischen P14 und P18 sind. SN können aus adulten Mäusen hergestellt werden, aber wir beobachten signifikant erhöht translationalen Aktivität mit SN von jungen Mäusen (Abbildung 8) vorbereitet.

Tabelle 1. Bestandteile der Bands aus der diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Fraktionierungen von homogenisiert Maus Kortex. ^3,5

Tabelle 2. Zusammenfassung der westlichen Bolzen Analyse der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Band Bestandteile. Relative Proteinkonzentrationen für jeden der Band Fraktionen isoliert mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten wurden mittels Western Blot bestimmt. No-Proteins vorhanden (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), oder> 0,8 (+++) fach größer als Protein im Überstand (S, zentrifugiert Kortex Homogenat), Vertreter der n = 3.

Schema 1: Schematische Darstellung einer SN Vorbereitung mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten Maus Gehirn Kortex wurden seziert, homogenisiert und zentrifugiert bei geringer Geschwindigkeit auf nicht-homogenisierte Gewebe, Zellen, ganze Organellen wie Kerne und Membranen zu entfernen.. Die diskontinuierliche Gradienten sollten klar definierte Schichten. Das Bild Einschub zeigt ein Beispiel für die Schichten, die gefärbt sind blau lediglich zu illustrativen Zwecken, um die Schichten zu visualisieren. Der Überstand wird auf der Spitze eines diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten geschichtet und zentrifugiert bei mittlerer Geschwindigkeit. Die SN-Band wird dann aus der Steigung abgerufen und ist einsatzbereit.

Abbildung 1. Homogenat Fraktionierung auf einen diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten. Maus Cortex wurde homogenisiert und auf einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten, die zu 6 Bands oder Fraktionen. Das gereinigte, aktive SNs (*) wurden in Band 5 gefunden.

Abbildung 2. SN Präparate geben eine heterogene Mischung von SNS, die präsynaptischen und postsynaptischen Elemente behalten. Eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines SN-Präparation aus C57BL / 6 Mäuse (Alter P13 bis P21) wie zuvor beschrieben hergestellt und zeigt SNs wurde mit erhaltener präsynaptischen und postsynaptischen Elementen durchgeführt. ^{2 , 6} Rote Pfeile weisen auf post-synaptischen Dichten. Maßstabsbalken ist 1 um.

Abbildung 3. Western-Blot-Analyse von SN Präparate zeigten, dass synaptischen und neuronalen Marker im gereinigten SNs wurden beibehalten (Band 5), aber die Fülle von anderen Markern deutlich reduziert werden. Immunoblots der Überstand (S, zentrifugiert kortikalen Homogenat) und Bands 1-6 von einer diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten wurden für β-Actin (Struktur-, Be-Kontrolle), GFAP (Astrozyten), GP73 (Golgi), HSC70 (zytoplasmatische und nukleare), Lamin-B1 (Kernenergie), Prohibitin (Mitochondrien), PSD95 sondiert (postsynaptischen Dichte ), SNAP25 (synaptic), Synaptophysin (synaptic) und β3-Tubulin (Neuronen-spezifische). Die Banden wurden mit einem Sturm 860 Phosphorimager, Vertreter der n = 3.

Abbildung 4. SNs sind aktiv und zeigen de novo Proteinsynthese über [35S]-Met Statuten. SNs wurden voräquilibriert bis 37 ° C für 10 min. Dann die SNS wurden unbehandelt oder vorbehandelt für 15 min mit 40 uM Anisomycin oder 1 uM Juglon bei 37 ° C durch Zugabe von [35S]-Met folgte, 20 ul Express Pro-Label-S35 Einfache Tag Mix, plus oder minus Glu bei 37 ° C für 30 min. Die Proben wurden unter Verwendung der Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, führen Sie auf einem 15% Polyacrylamidgel, getrocknet und quantitativ mit Hilfe eines Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM.

Abbildung 5. Band 5 aus der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten enthielt die höchsten Ebenen der de novo Proteinsynthese. Bands 4, 5 und 6 und der Überstand (S, zentrifugiert kortikalen Homogenat) wurden voräquilibriert bis 37 ° C für 10 min. Dann [35S]-Met, Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag wurde hinzugefügt, plus oder minus Glu bei 37 ° C für 30 min. Die Proben wurden unter Verwendung der Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, führen Sie auf einem 15% Polyacrylamidgel, getrocknet und quantitativ mit Hilfe eines Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM.

Abbildung 6. SNs aus einer Filtration Verfahren hergestellten enthalten mehr gebrochen Membranen und weniger ganze SNs als SNs aus der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Verfahren hergestellt. SNs wurden, indem homogenisiert Kortex durch eine Reihe von Filtern mit abnehmender Porengröße wie zuvor beschrieben vorbereitet. ^3,14-15 Ein Aliquot der SNS durch die Filtration Methode hergestellt über einen diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten wurde zentrifugiert und im Vergleich zu einer äquivalenten Menge Material unter Verwendung des diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode.

Abbildung 7. SNs aus einer Filtration Verfahren hergestellten enthalten weniger de novo Protein-Synthese-Aktivität als SNs her vorbereitetm der diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode. SNs wurden, indem homogenisiert Kortex durch eine Reihe von Filtern mit abnehmender Porengröße wie zuvor beschrieben, ^3,14-15 und durch den diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten Methoden hergestellt. SNs von beiden Präparate wurden voräquilibriert bis 37 ° C für 10 min. Dann [35S]-Met, Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag wurde hinzugefügt, plus oder minus Glu bei 37 ° C für 30 min. Die Proben wurden unter Verwendung der Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit, führen Sie auf einem 15% Polyacrylamidgel, getrocknet und quantitativ mit Hilfe eines Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM.

Abbildung 8. SNs von jüngeren Mäusen (P14) haben eine größere translatorische Tätigkeit als ältere Mäuse (P85). SNs aus verschiedenen alten Mäusen unter Verwendung des diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Gradienten-Methode, voräquilibriert bei 37 ° C für 10 min wurden hergestellt, behandelt oder unbehandelt in der mit Glu Gegenwart von [35S]-Met (Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag) für 30 min, schockgefroren und später mit dem Pierce SDS-PAGE Sample Prep Kit gereinigt. Die SNS wurden dann auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel laufen, getrocknet und abgebildet auf einem Molecular Dynamics Storm 860 Phosporimager, Vertreter der n = 3, ± SEM. SNs von P14 Mäusen wurden mindestens 3-fach aktiver als P85 Mäusen.

Discussion

Die diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Gradienten Vorbereitung hierin beschriebenen ist eine schnelle, zuverlässige Methode, um aktiv SNS, die in einer Vielzahl von synaptischen Übertragung Experimente verwendet werden können isolieren. Dieser Gradient-Methode, die auf der Methode von Dunkley et al., ^3,4 entwickelten, ist eine subzelluläre Fraktionierung Gehirn Verfahren, das sowohl prä-und postsynaptischen Membran-derived Bläschen, die miteinander verbunden sind, isoliert. Ohne weitere Reinigung dieser SN...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Micro BCA Protein Assay Kit	Durchstechen	23235
CaCl 2	Fischer	C79-500
CO 2-Gas	Airgas (UW-MDS)	CD 50
EDTA	RPI	E57020
EtOH	Fischer	A407SK-4
HCl	Fischer	A142-212
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
KH 2 PO 4	Fischer	P285-500
PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit	Durchstechen	89888
NaCl	RPI	S23020
NaHCO 3	Fischer	BP328-500
Na 2 PHO 4	Fischer	S381-500
Sucrose	RPI	S24060
Tris Base	RPI	T60040
Tetrodotoxin	Sigma	T5651
Express Pro-Label-Mix S35 Einfache Tag	Perkin Elmer	NEG772
Ausstattung	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Dissection-Tools
Dounce Homogenisator, 7 mL (kommt mit zwei Glas-Stößel mit der Aufschrift "A" und "B")	Wheaton
P1000 Gilson Pipetman	Gilson	F123602
Allegra 6KR Centrifuge	Beckman Coulter	366830
GH 3,8 Rotor, Ausschwingrotor	Beckman Coulter	360581
Beckman J2-21 Zentrifuge	Beckman
Beckman Röhrchen mit Kappen	Beckman	355672
Weiß ummauerten Adapter	Beckman	342327
Blau ummauerten Adapter	Beckman
JA-17 Rotor, Festwinkelrotor	Beckman	369691

Name der Antikörper	Firma	Katalog-Nummer	Wirtsarten	Verdünnungsfaktor
β-Aktin	Sigma	A5441	Maus	1:2000
GFAP	Santa Cruz	sc-65343	Maus	1:200
GP73	Santa Cruz	Sc-134509	Kaninchen	1:200
HSC70	Santa Cruz	sc-7298	Maus	1:200
Laminβ	Santa Cruz	Sc-6261	Ziege	1:200
Prohibitin	Santa Cruz	sc-28259	Kaninchen	1:200
PSD95	Millipore	MAB1596	Maus	5 ug / ul
SNAP25	AbCam	ab5666-100	Kaninchen	1:2000
Synaptophysin	Millipore	MAB368	Maus	1:500
β-3-Tubulin	Santa Cruz	sc-80016	Maus	1:200