Visualisierung des intrazellulären Transports von Fracht in kultivierten Astrozyten

Zusammenfassung

Quelle: Creighton, B. A., et al. Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Frachten in Astrozyten. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Visualisierung des intrazellulären Frachttransports in kultivierten Astrozyten unter Verwendung einer fluoreszierenden acidotropen Sonde, die selektiv saure endolysosomale Vesikel markiert. Die Zeitraffer-Bildgebung und die Z-Stapel-Erfassung mit einem konfokalen Mikroskop ermöglichen die Verfolgung von fluoreszenzmarkierter Fracht über das dreidimensionale Zellvolumen. Die Analyse unterscheidet stationäre Fracht von Fracht, die sich in Richtung Zellperipherie oder Zellkern bewegt, und gibt so Einblicke in die intrazelluläre Transportdynamik.

Protokoll

1. Transfektion von fluoreszenzmarkierten Plasmiden

1. Am Tag vor der Transfektion oder Markierung säen die Astrozyten mit der gewünschten Dichte für die Bildgebung 24-48 Stunden nach der Transfektion. Eine empfohlene Dichte für 24-Well-Platten oder 14-mm-Glasboden-Wells beträgt 2 x 104 Zellen/Well.
   HINWEIS: Dieses Protokoll ist optimiert für die Transfektion von Astrozyten, die auf 12-mm-Glasdeckgläsern auf 24-Well-Platten oder 14-mm-Glasboden-Wells mit einer auf Lipofektion basierenden Methode plattiert sind. Die Reagenzien sollten je nach Größe der Kulturschale, in der die Astrozyten wachsen, skaliert werden.
2. Verdünnen Sie das Lipofektionsreagenz (Materialtabelle) in Medien mit reduziertem Serum (Materialtabelle). Um das Verhältnis von Lipofektionsreagenz zu DNA zu optimieren, testen Sie eine Reihe geeigneter Verdünnungen. Wenn Sie beispielsweise das in diesem Protokoll verwendete Reagenz (Materialtabelle) verwenden, verdünnen Sie 2, 3, 4 und 5 μl des Lipofektionsreagenzes in 50 μl reduziertem Serummedium.
3. 5 μg hochreine DNA in 250 μl Medium mit reduziertem Serum verdünnen. Fügen Sie 5 μl Lipofektionsverstärker-Reagenz hinzu (Materialtabelle). Kombinieren Sie das Röhrchen mit dem Lipofektionsreagenz mit einem gleichen Volumen der DNA-Lipofektionsverstärker-Mischung. Durch Pipettieren mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
4. Entfernen Sie das Astrozyten-Kulturmedium und geben Sie die Transfektionsmischung (Schritt 1.3) tropfenweise in die Zellen. Nach einer 6-stündigen Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 ist der Transfektionskomplex durch ein geeignetes Volumen Astrozyten-Kulturmedien (2 mL für 14-mm-Glasbodenschalen) zu ersetzen. Inkubieren Sie weitere 24-72 Stunden, bevor Sie mit der Bildaufnahme fortfahren. Überwachen Sie die Dauer des Inkubationsschritts genau, um das beste Gleichgewicht zwischen Proteinexpression und Zellviabilität zu erreichen.

2. Markierung von späten Endosomen/Lysosomen mit Fluoreszenzsonden

HINWEIS: Einige Ladungen können mit Fluoreszenzfarbstoffen mit hoher Affinität für frachtspezifische Proteine markiert werden. Das folgende Beispiel erlaubt die Markierung von späten Endosomen/Lysosomen mit einer fluoreszierenden acidotropen Sonde.

1. Die lysosomale Markierungssonde (Materialtabelle) in 200 μl Astrozyten-Kulturmedien auf eine Arbeitskonzentration von 1 μM verdünnen und auf Astrozyten aus Schritt 1.1 mit einer Dichte von 2 x 104 Zellen/Vertiefung auftragen. 30 min bei 37 °C inkubieren.
2. Waschen Sie die Zellen einmal mit warmen Astrozyten-Kulturmedien und ersetzen Sie sie durch bildgebende Medien (Materialtabelle). Fahren Sie sofort mit dem Live-Imaging fort.

3. Bildaufnahme mit einem Zeitraffer-Bildgebungssystem

HINWEIS: Die Live-Bildgebung im Zeitraffer sollte mit einem Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera, einem bestimmten Fokus, einer Inkubationskammer und einem 40-fach-Ölobjektiv mit hoher numerischer Apertur (z. B. Plan-Apochromat 1.4NA) ausgestattet ist. Für die Zeitraffer-Bildgebung steht eine Vielzahl von Erfassungssoftware zur Verfügung. Die Auswahl des Mikroskopiesystems und der Erfassungssoftware sollte sich nach deren Verfügbarkeit und Eignung für die Ziele der jeweiligen Studie richten. Im Folgenden finden Sie einige allgemeine Richtlinien.

1. Stellen Sie die Kulturkammer oder -schale in den entsprechenden Adapter auf den Mikroskoptisch. Wählen Sie mit Epifluoreszenzlicht die Zelle(n) aus, die fluoreszierende Proteine exprimieren oder sondieren, die aufgezeichnet werden sollen. Passen Sie die fluoreszierende Probenbeleuchtung an, um die ausgewählte(n) Zelle(n) mit der Digitalkamera zu visualisieren. Vermeiden Sie die Verwendung von hoher Beleuchtung, die Photobleiche und Phototoxizität verursachen könnte. Passen Sie Fokus und Zoom an.
2. Erfassen Sie einzelne Z-Stapel-Zeitrafferserien mit einer Frequenz von 1 Bild alle 2 s für Zeitintervalle zwischen 300 s und 500 s mit den Zoom- und Definitivfokusfunktionen.
   HINWEIS: Die Transportdynamik (Geschwindigkeit, Bewegungsfrequenz usw.) variiert je nach dem interessierenden Protein, daher kann der Zeitverlauf der Erfassung angepasst werden müssen. Zum Beispiel sind Mitochondrien weniger beweglich als Lysosomen und weisen häufige Pausen auf. In diesem Fall ist es angemessener, die Erfassungsparameter auf 1 Bild alle 5 s für 800 s einzustellen.
3. Speichern Sie Zeitrafferbilder und exportieren Sie sie als AVI- oder TIFF-Stack-Dateien.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovine Serum	Gemini	100-106	Hitzeinaktiviert
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Pinzette mit feiner Spitze	F.S.T	11254-20	Style #5
Fluoreszenzlichtquelle	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
Glasbodenschalen	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Schale | Nr. 1.5 Deckglas | 14 mm Glasdurchmesser | Unbeschichtete
Graefe Pinzette	F.S.T	11054-10	Graefe Irispinzette mit gebogenen Spitzen
Grün fluoreszierender Farbstoff, der saure Kompartimente (späte Endosomen und Lysosomen) färbt	Technologies	L7526	LysoTracker Grün DND 26. Voraufgelöst in DMSOS zu einer 1 mM Stammlösung. Auf die endgültige Arbeitskonzentration in dem Wachstumsmedium oder Puffer der Wahl verdünnen.
Hank's Balanced Salt Solution (10x)	Gibco	14065-056	Magnesium- und Kalzium-freie
Bildgebung Media	Life Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Inverses Konfokalmikroskop	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Reagenz
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX Reagenz
Orbitaler Schüttinkubator	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , orbitaler Schüttinkubator mit Temperatur- und Geschwindigkeitsregelung
Penicillin/Strepomycin-Lösung (100x)	Gen Clone	25-512
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysinhydrobromid	Sigma	P7405	In Tris-Puffer, pH 8,5, bei 1 mg/ml auflösen. Für die Langzeitlagerung einfrieren. Vermeiden Sie Gefrier- und Auftauzyklen
Reduziertes Serummedium	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Gewebekulturflaschen	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. 100 % abgewinkelter Halszugang, hydrophobe belüftete Filterkappe mit 0,22 μm
Gewebekultur-Inkubator	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, Gewebekultur-Inkubator mit Temperatur-, Feuchtigkeits- und CO2-Kontrolle
Tris-Base	Sigma	T1503	8,402 g gelöst zu einem Liter in Wasser mit 4,829 g Tris HCl zu 0,1 M Tris Puffer, pH 8,5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4,829 g gelöst zu einem Liter in Wasser mit 8,402 g Tris Base zu 0,1 M Tris Puffer, pH 8,5

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