Hochauflösende dreidimensionale konfokale Bildgebung der Blut-Hirn-Schranke in einem Maus-Hirn-Schnitt

Zusammenfassung

Quelle: Villaseñor, R und Collin. L. Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut-Hirn-Schranke: Bildgebung, 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung der Transzytose. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt eine hochauflösende 3D-Bildgebung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) mittels konfokaler Mikroskopie und zeigt Antikörper-gefärbte Maushirnschnitte zur Analyse von BHS-Komponenten und intrazellulären Strukturen, die für die Untersuchung der Hirnhomöostase, neurovaskulärer Wechselwirkungen und krankheitsbedingter BHS-Dysfunktion geeignet sind.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Hochauflösende konfokale Bildgebung der Blut-Hirn-Schranke
2. Führen Sie die Bildaufnahme mit einem geeigneten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (siehe Materialtabelle) mit Laserlinien bei 405, 488, 561 und 633 nm zur Anregung von Fluorophoren im blauen, grünen, orangefarbenen und roten Bereich des Lichtspektrums durch. Verwenden Sie für die Bildaufnahme ein 63X-Ölobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,4.
3. Stellen Sie im Aufnahmemenü der Software, die das Mikroskop steuert, die Bildaufnahmeparameter ein. Wählen Sie im Dropdown-Menü von "Bildgröße" einen Wert von 1024 x 1024 Pixeln aus. Ändern Sie die Pixelgröße auf einen Wert zwischen 200 und 300 nm, indem Sie den Wert des Menüs 'Zoom' anpassen."
   HINWEIS: Für die Analyse intrazellulärer Strukturen reduzieren Sie die Pixelgröße auf 75 nm. Diese Einstellung für die Bildgröße erhöht die Aufnahmezeit erheblich und kann auf 512 x 512 Pixel reduziert werden, um die Aufnahmezeit zu verkürzen, indem ein kleineres Sichtfeld abgebildet wird.
4. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Erfassungsgeschwindigkeit" einen Wert von 400 Hz, d. h. 400 Zeilen pro Sekunde. Wählen Sie im Menü "Systemeinstellungen" das Dropdown-Menü "Pixeltiefe" und ändern Sie den Wert auf 12 Bit.
5. Schalten Sie in der Mikroskopsoftware auf der Registerkarte "Erfassung" die Option für die sequentielle Rahmenerfassung ein. Stellen Sie die Dicke des optischen Schnitts für jeden Kanal auf einen Wert zwischen 0,75 und 1 μm ein, indem Sie den Wert im Menü "Lochblende" ändern.
6. Aktivieren Sie im Panel für die Fluoreszenzanregung den Laser, der erforderlich ist, um die Fluorophore in der Probe optimal anzuregen, z. B. eine 488-nm-Laserlinie für ein grün emittierendes Fluorophor.
   HINWEIS: Verwenden Sie einen Fluorophor-Spektrenbetrachter (siehe Materialtabelle), um den geeigneten Anregungslaser auszuwählen.
7. Bewegen Sie im Bedienfeld für die Fluoreszenzdetektion den Schieberegler, um die Wellenlängen auszuwählen, die in jedem Kanal gemessen werden, z. B. zwischen 510 und 550 nm für ein grün emittierendes Fluorophor.
   HINWEIS: Verwenden Sie einen Fluorophor-Spektrenbetrachter (siehe Materialtabelle), um die geeigneten Detektionswellenlängen auszuwählen.
8. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl mit einem Brechungsindex von 1,52 auf das Deckglas mit dem Gehirnteil, um es dem Brechungsindex des Glasdeckglases und des Objektivs anzupassen. Legen Sie die Probe in das Mikroskop und schalten Sie die Epifluoreszenzlampe ein, um die Probe mit dem Mikroskopfernglas sichtbar zu machen.
9. Wechseln Sie mit den Tasten am Mikroskopstativ das Filterrad, um einen Filter auszuwählen, der für die Visualisierung von DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol)-gefärbten Zellkernen geeignet ist. Verwenden Sie den Grobfokus, um das Signal von DAPI-gefärbten Kernen in den Fokus zu bringen.
10. Mit den Tasten am Mikroskopstativ können Sie die Filter wechseln, um das Signal von Gefäßmarkern (z. B. CollagenIV oder CD31) zu visualisieren und das Sichtfeld auf ein einzelnes Kapillarsegment zu zentrieren.
11. Drücken Sie die Taste, um den Live-Scan-Modus zu starten. Passen Sie während des Scannens die Verstärkung und die Laserintensität für jeden Kanal an, um den Dynamikbereich der Bilder zu maximieren und eine Pixelsättigung zu vermeiden.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Nachschlagetabelle, die gesättigte Pixel beschriftet, um eine Übersättigung visuell zu beurteilen. Um eine Signalübersättigung zu vermeiden, passen Sie die Einstellungen mit der Probe an, die voraussichtlich das höchste Fluoreszenzsignal aufweist.
12. Stellen Sie den Wert für die Zeilenmittelung auf 2,
    HINWEIS: Wenn Sie höhere Erfassungsgeschwindigkeiten verwenden, erhöhen Sie diesen Wert, um das Rauschen zu reduzieren.
13. Legen Sie Anfangs- und Endabschnitte für die Durchführung optischer Z-Stapel fest, die sich über das gesamte Volumen der Kapillare erstrecken. Verwenden Sie eine Schrittweite von 0,45 μm.
    HINWEIS: Wenn Bilder für die nachfolgende Quantifizierung verwendet werden, behalten Sie die gleichen Erfassungseinstellungen für den gesamten Datensatz bei.
14. Für die Quantifizierung erfassen Sie 10 bis 20 Z-Stacks pro Schnitt von mindestens drei verschiedenen Mäusen für statistische Vergleiche.
    HINWEIS: Erfassen Sie den vollständigen Datensatz in derselben Sitzung, um die Variabilität zu reduzieren, die sich aus Probenbleichen und Laserintensitätsschwankungen ergibt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
monoklonaler Antikörper-Klon ER-MP12 gegen CD31/PECAM	Novus Biologicals	MCA2388	Labels Brain Endothelial CellsUse at dilution 1:100mit esel polyklonales Anti-Ratten-IgG (H+L) in Verbindung mit geeignetem AlexaFluor-Farbstoff nachweisen, verwendet bei Verdünnung 1:400
Monoklonaler Antikörper der Ratte gegen Podocalyxin	R&D Systems	MAB1556	Labels Lumen von KapillarenVerwendung bei Verdünnung 1:100Nachweis mit polyklonalem Anti-Ratten-IgG (H+L) mit Esel in Verbindung mit geeignetem AlexaFluor-Farbstoff, Verwendung bei Verdünnung 1:400
Polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen KollagenIV	Biotrend	BT21-5014-70	Etiketten Basalmembran von KapillarenVerwendung bei Verdünnung 1:100Nachweis mit Esel polyklonales Anti-Kaninchen IgG (H+L) gekoppelt mit geeignetem AlexaFluor-Farbstoff, verwendet bei Verdünnung 1:400
Polyklonaler Antikörper aus Ziege gegen CD13	F&E-Systeme	AF2335	Etiketten PerizytenVerwendung bei Verdünnung 1:100Nachweis mit Esel polyklonales Anti-Kaninchen-IgG (H+L) in Verbindung mit geeignetem AlexaFluor-Farbstoff, verwendet in Verdünnung 1:400
Monoklonaler Maus-Antikörperklon G-A-5 gegen GFAP, gekoppelt an Cy3	Abcam	ab49874	Markierungen AstrozytenVerwendung bei Verdünnung 1:100
Kaninchen polyklonaler Antikörper gegen Iba-1	Wako	019-19741	Markierungen MikrogliaVerwendung bei Verdünnung 1:100Nachweis mit Esel polyklonales Anti-Ratten-IgG (H+L) gekoppelt mit geeignetem AlexaFluor-Farbstoff, verwendet in Verdünnung 1:400
Monoklonaler Antikörper ABL93 von Ratte gewinnt LAMP2	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	Etiketten LysosomenVerwendung in einer Verdünnung von 1:100Nachweis mit einem polyklonalen Anti-Ratten-IgG (H+L) von Esel in Verbindung mit einem geeigneten AlexaFluor-Farbstoff, Verwendung in einer Verdünnung von 1:400
Polyklonaler Esel-Antikörper gegen Maus-IgG (H+L) AlexaFluor594	LifeTechnologies	A21203	Verwendung in einer Verdünnung von 1:400
Polyklonaler Esel-Antikörper gegen Maus-IgG (H+L) AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	Verwendung in einer Verdünnung von 1:400
Polyklonaler Antikörper aus der Ziege gegen Maus-IgG (H+L) AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	Verwendung in der Verdünnung 1:400
Fluoreszierendes Eindeckmedium	Dako	S3023	Dako fluoreszierendes Eindeckmedium
Laser Scanning Konfokales Mikroskop	Leica Microsystems	NA	Leica TCS SP8 X mit HyD-Detektoren und Weißlichtlaser Bildverarbeitungssoftware
	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF Version 3.1.0 Build 8587
Bildanalysesoftware	Bitplane Scientific Software	NA	Imaris Version 7.6.5 Build 31770 für x64
FluoreszenzspektrenViewer	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

Ratte