Subretinale Injektion von viralen Vektoren in das retinale Pigmentepithel in einem Mausmodell

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Park, S. W., et al. Limbaler Zugang-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie im retinalen Pigmentepithel von Mäusen. J. Vis. Exp. (2015)

Das Video beschreibt die Methode zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in das retinale Pigmentepithel (RPE) in einem Mausmodell. Es beschreibt das Verfahren von der Anästhesie und der Augenvorbereitung bis hin zur präzisen lentiviralen Vektorverabreichung, um die Genintegration und -expression im RPE sicherzustellen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung des Injektionskits und der viralen Vektoren

Bereiten Sie die Mikroliterspritze vor, die mit einer stumpfen 33-G-Nadel ausgestattet ist, die mit Ethylenoxidgas sterilisiert wurde. Verdünnen Sie die viralen Vektoren in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) für einen ausreichenden Titer im Mikroröhrchen (d. h. 1 x 10⁶ TU/μl). Spülen Sie die Spritze mehrmals mit viralen Vektoren, um Totraum in der Spritze zu entfernen.

2. Subretinale Injektion von viralen Vektoren

Anästhesie der erwachsenen Mäuse (d. h. 6 - 8 Wochen alt) mit einer intraperitonealen Injektion der Mischung aus Tiletamin und Zolazepam (1:1, 2,25 mg/kg Körpergewicht) und Xylazinhydrochlorid (0,7 mg/kg Körpergewicht) oder einem alternativen geeigneten Anästhesieschema.
Erweitern Sie die Pupillen mit einem Augentropfen aus Phenylephrin 0,5 % und Tropicamid 0,5 %.
Bereiten Sie die Mikroliterspritze vor, indem Sie sie mit 1,5 - 2 μl viralen Vektoren beladen.
Öffnen Sie das Augenlid und schieben Sie das Auge hervor, um den Äquator für eine bequeme Injektion freizulegen. Fokussieren Sie sich unter dem Operationsmikroskop darauf. Behalten Sie die Position des hervorstehenden Auges bei, bis die Injektion abgeschlossen ist, da es sonst während der Injektion zu einer Verschiebung der Nadel kommen kann. Um den Augapfel fest zu halten, platzieren Sie die Finger außerhalb des Augenhöhlenrands.
Tragen Sie einen Tropfen ophthalmische viskoelastische Lösung auf die Hornhautoberfläche auf.
Legen Sie einen kleinen runden Objektträger auf die Oberseite der Hornhaut, um die Netzhaut sichtbar zu machen.
Stechen Sie ein kleines Loch am leichten hinteren Ende des Limbus mit einer sterilen 30 G 1/2 Nadel für eine weitere subretinale Injektion. Der Einfachheit halber machen Sie das Loch für das rechte Auge unterlegen und für das linke Auge höher.
HINWEIS: Wenn das Loch an der Schläfe oder Nase gemacht wird, ist es schwierig, nach der Injektion vom Augenlid bedeckt zu werden. Die erste Punktion sollte etwas hinter dem Limbus erfolgen, um die limbalen Gefäße zu vermeiden, die entlang des Limbus verlaufen und leicht zu erkennen sind. Achte darauf, dass du die Linse nicht mit einer Nadel triffst, während du den ersten Einstich machst. Führen Sie nicht die gesamte Fase der Nadel ein, um eine Durchstich der Linse zu vermeiden.
Führen Sie die stumpfe 33-G-Nadel der Mikroliterspritze durch das vorpunktierte Loch und nähern Sie sich der Nadel dem subretinalen Raum, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist.
HINWEIS: Für die subretinale Injektion beträgt der beste Annäherungswinkel der Nadel etwa 45 Grad gegen die Irisebene, und die stumpfe Nadel sollte nach hinten in Richtung des peripapillären Bereichs geschoben werden. Das gestrichelte Quadrat zeigt den in Abbildung 1 vorgeschlagenen Nadelweg durch die Glaskörperhöhle für die subretinale Injektion.
HINWEIS: Beim Durchstechen (oder Passieren) der Netzhautschichten ist kein Widerstand zu spüren, da sie sehr weich sind. Das erste Gefühl eines leichten Widerstands deutet also darauf hin, dass die Nadel die RPE-Schicht (Retinales Pigmentepithel) bereits berührt hat und das Einstechen der Nadel gestoppt werden sollte. Achten Sie darauf, nicht mit übermäßigem Druck in das Skleralgewebe einzudringen, da die Nadel möglicherweise im subretinalen Raum platziert werden sollte. Sticht die Nadel durch übermäßige Kraft in das Skleralgewebe, dringt sie widerstandslos in die extraokulären Orbitalräume ein. (Dieser Schritt ist entscheidend)
Injizieren Sie die viralen Vektoren (z. B. 1 x 10⁶TU/μl) sanft und ohne Zittern in den subretinalen Raum, um unerwünschte Gewebeschäden zu vermeiden. Ziehen Sie dann die Nadel vorsichtig zurück. Halten Sie den Augapfel während der Injektion fest, wie in 2.4 beschrieben.
Beobachten Sie die Bildung von subretinalen Bläschen nach der Injektion unter einem Operationsmikroskop, um sicherzustellen, dass keine Netzhautblutungen auftreten.

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Ergebnisse

Abbildung 1. Schematische Darstellung der subretinalen Injektion. H&E (Hämatoxylin- und Eosin-Färbung) gefärbter Querschnitt des Mausauges, der die Strukturen mit einem markierten Nadelweg für die subretinale Injektion darstellt (ein ges...