Abbildung des mitochondrialen Redoxzustands in primären Neuronen mit Hilfe eines ratiometrischen Indikators

Zusammenfassung

Quelle: Katsalifis, A., et al. Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Bildgebung des mitochondrialen Redoxzustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Fluoreszenzindikators. Durch Anlegen von zwei Anregungswellenlängen unter einem Fluoreszenzmikroskop wird das Fluoreszenzintensitätsverhältnis gemessen, um die mitochondriale Oxidation zu beurteilen. Das Protokoll umfasst die Stimulation von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA), um den Kalziumeinstrom und die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zu induzieren, gefolgt von einer Kalibrierung mit Oxidations- und Reduktionsmitteln zur Quantifizierung der NMDA-induzierten mitochondrialen Oxidation

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Protokoll

1. Belastungszellen mit Tetramethylrhodaminethylesterperchlorat (TMRE

)HINWEIS: In diesem Protokoll wird TMRE im Nicht-Quench-Modus bei einer Endkonzentration von 20 nM verwendet. Im Allgemeinen sollte die geringstmögliche Konzentration von TMRE verwendet werden, die am Mikroskop der Wahl noch eine ausreichende Signalintensität bietet. Aufgrund der ungleichmäßigen Verdunstung kann das Volumen des Mediums in verschiedenen Vertiefungen in Langzeit-Primärkulturen unterschiedlich sein. Um eine gleichbleibende TMRE-Konzentration in allen Vertiefungen zu gewährleisten, fügen Sie TMRE nicht direkt in die Vertiefungen hinzu. Ersetzen Sie stattdessen das Medium in jeder Vertiefung durch die gleiche Menge TMRE-haltiges Medium. Das folgende Protokoll ist für primäre Neuronen in 24-Well-Platten konzipiert, die ~1 ml Medium pro Well enthalten.

1. Sammeln Sie in einer Laminar-Flow-Haube der Gewebekultur 500 μl Medium aus jeder Vertiefung in einem einzigen konischen Röhrchen.
2. Geben Sie pro Vertiefung 0,5 μl 20 μM TMRE-Material in das konische Röhrchen (z. B. 12 μl für 24 Vertiefungen).
3. Saugen Sie das restliche Medium vorsichtig aus der ersten Vertiefung an und ersetzen Sie es durch 500 μl TMRE-haltiges Medium. Fahren Sie mit den verbleibenden Vertiefungen fort, Well-by-Well.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Zellen nicht austrocknen zu lassen und die Zellen nicht zu stören.
4. Setzen Sie die Zellen wieder in den Inkubator ein und warten Sie mindestens 60 Minuten, bis der Farbstoffausgleich erreicht ist.
   HINWEIS: Die Ladezeit kann ohne nachteilige Auswirkungen auf mehrere Stunden verlängert werden.
5. Um eine konsistente TMRE-Konzentration und Äquilibrierung während des gesamten Bildgebungsexperiments zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass eine Endkonzentration von 20 nM TMRE in den Bildgebungspuffer und alle Stimulationslösungen aufgenommen wird.

2. Optimierung der Einstellungen des konfokalen Rastermikroskops

HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, den besten Kompromiss zwischen Bildqualität und Zellviabilität während der Live-Bildgebung zu finden. In diesem Abschnitt wird die Optimierung der Einstellungen für die Bildgebung von reduktionsoxidationsempfindlichen grün fluoreszierenden Proteinen (roGFP) beschrieben. Wenn eine multiparametrische Bildgebung durchgeführt wird, muss eine ähnliche Optimierung, einschließlich der Überprüfung einer stabilen Basislinie ohne Anzeichen von Bleichen oder Phototoxizität, für die zusätzlichen Indikatoren durchgeführt werden.

1. Starten Sie das konfokale Mikroskop und laden Sie die Standardeinstellungen für die GFP-Bildgebung (488 nm Anregung, 505 - 550 nm Emission).
2. Stellen Sie den Detektor auf 12 Bit oder 16 Bit ein. Anmerkung: In der Regel reichen 8 Bit für die quantitative Bildgebung nicht aus.
3. Aktivieren Sie den sequentiellen Scan-Modus und fügen Sie eine zweite Sequenz/Spur hinzu (405 nm Anregung, 505 - 550 nm Emission).
4. Wählen Sie für beide Kanäle eine Pseudocolor-Lookup-Tabelle aus, die über- und unterbelichtete Pixel anzeigt (z. B. GLOW OU).
5. Wählen Sie ein Objektiv aus, das für das Objekt von Interesse geeignet ist.
   HINWEIS: 10x-40x eignen sich für die Einzelzellanalyse, 63x-100x sind für die Einzelmitochondrienanalyse geeignet.
6. Montieren Sie ein Deckglas mit Zellen in die Bildgebungskammer, fügen Sie 1 ml Bildgebungspuffer hinzu und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop.
7. Verwenden Sie das Okular und das Durchlicht, um die Zellen zu fokussieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie kein Epifluoreszenzlicht, um Zellen zu lokalisieren und zu fokussieren. Selbst bei geringer Leistung wirkt sich dies nachteilig auf die Zellen aus.
8. Nehmen Sie Bilder mit unterschiedlichen Pixelformaten auf. Wählen Sie auf der Grundlage dieser Bilder die niedrigste Pixelzahl aus, die eine akzeptable Auflösung der interessierenden Struktur ergibt.
   HINWEIS: In der Regel eignen sich 512 x 512 Pixel gut für die Einzelzellbildgebung mit 20- und 40-fachen Objektiven, und 1024 x 1024 oder 2048 x 2048 Pixel eignen sich in der Regel gut für die Einzelmitochondrien-Bildgebung mit einem 63-fachen Objektiv.
9. Nehmen Sie Bilder mit unterschiedlichen Lochblendengrößen auf. Wählen Sie auf der Grundlage dieser Bilder die größte Lochblendengröße aus, die eine akzeptable Auflösung der interessierenden Struktur ergibt.
   HINWEIS: In der Regel funktionieren 3-7 luftige Einheiten gut.
10. Nehmen Sie Bilder mit unterschiedlichen Laserintensitäten auf.
    1. Passen Sie die Detektorverstärkung und den Schwellenwert entsprechend an. Wählen Sie auf der Grundlage dieser Bilder die niedrigste Laserintensität aus, die eine akzeptable Signalintensität und ein akzeptables Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis ergibt.
       1. Um das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu bestimmen, messen Sie die Signalintensität in einer Region of Interest (ROI), die Zellen oder Mitochondrien enthält (ROI1) und in einer ROI ohne Zellen oder Mitochondrien (ROI2). Teilen Sie dann die Intensität von ROI1 durch die Intensität von ROI2.
          >HINWEIS: Streben Sie ein Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis von >3 und Signalintensitäten einzelner ROIs von 200-1.000 für 405 nm Anregung mit 1-3 % Laserleistung und Intensitäten einzelner ROIs von 300-1.500 für 488 nm Anregung mit 1 % Laserleistung an.
11. Nehmen Sie Bilder mit unterschiedlichen Scangeschwindigkeiten und der Anzahl der durchschnittlichen Frames auf. Nehmen Sie 4-5 Bilder für jede Kombination von Einstellungen auf. Wählen Sie auf der Grundlage dieser Bildserien die Einstellungen mit der höchsten Geschwindigkeit und dem niedrigsten Durchschnitt aus, die ein akzeptables Bildrauschen und eine Variabilität von Bild zu Bild ermöglichen.
    HINWEIS: Eine Scangeschwindigkeit von 600 Hz und 1-2 Bilder für die Mittelwertbildung funktionieren in den meisten Fällen gut.
12. Nehmen Sie mit einem neuen Deckglas eine Zeitrafferserie mit den optimierten Einstellungen auf.
    HINWEIS: Die Dauer und das Bildintervall der Serie sollten denen der geplanten Experimente entsprechen.
13. Geben Sie am Ende der Zeitrafferserie 1 ml 2x Diamid (DA)-Lösung in die Aufnahmekammer. Bild für weitere 2 Min.
14. Aspirieren Sie den Bildgebungspuffer mit einer Peristaltikpumpe oder einer Handpipette. 1 ml 1x Dithiothreitol (DTT)-Lösung hinzufügen. Bild für weitere 5 Min.
15. Analysieren Sie das Zeitrafferexperiment.
    1. Stellen Sie sicher, dass keiner der beiden Kanäle während der DA- und DTT-Behandlung mit den optimierten Einstellungen über- oder unterbelichtet wird.
    2. Stellen Sie sicher, dass keiner der beiden Kanäle während der Zeitrafferaufnahme ein erhebliches Ausbleichen aufweist. Streben Sie einen Intensitätsverlust von <2 % zwischen dem ersten und dem letzten Bild an.
    3. Stellen Sie sicher, dass sich das Verhältnis 405:488 während der Bildgebung nicht wesentlich ändert.
16. Wiederholen Sie den gesamten Vorgang iterativ mit mehreren Deckblättern, bis Einstellungen definiert sind, die konsistent akzeptable Ergebnisse liefern.

3. Beurteilung des basalen Redoxstatus

1. Starten Sie das Mikroskop und laden Sie die optimierten Einstellungen aus Abschnitt 2.
2. Stellen Sie den Frame-Durchschnitt auf 3-5 ein.
3. Montieren Sie ein Deckglas mit Zellen in die Bildgebungskammer, fügen Sie 1 ml Bildgebungspuffer hinzu und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop.
4. Verwenden Sie das Okular und das Durchlicht, um die Zellen zu fokussieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie kein Epifluoreszenzlicht, um Zellen zu lokalisieren und zu fokussieren. Selbst bei geringer Leistung wirkt sich dies nachteilig auf die Zellen aus.
5. Wechseln Sie in den Scan-Modus und verwenden Sie den 488-nm-Kanal in der Live-Ansicht, um Zellen für die Bildgebung zu fokussieren und zu lokalisieren.
6. Verwenden Sie die Multipoint-Funktion, um 3-5 Sichtfelder auf dem Deckglas auszuwählen.
7. Nehmen Sie ein Basisbild auf.
8. Geben Sie 1 mL 2x DA-Lösung in die Kammer.
9. Verwenden Sie nach 1, 2 und 3 Minuten die Live-Ansicht, um den Fokus zu bestätigen/anzupassen und dann ein Bild aufzunehmen.
   HINWEIS: Die Zellen sind in der Regel nach 2 Minuten vollständig oxidiert.
10. Ersetzen Sie den Puffer in der Bildgebungskammer durch 1 mL 1x DTT-Lösung.
11. Verwenden Sie nach 3 und 5 Minuten die Live-Ansicht, um den Fokus zu bestätigen/anzupassen und dann ein Bild aufzunehmen.
    HINWEIS: Zellen sind in der Regel nach 4-5 Minuten vollständig verkleinert.

4. Live-Bildgebung von Akutbehandlungen

HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt die Bildgebung der mitochondrialen Redoxreaktion auf die NMDA-Behandlung. Die Bildintervalle und die Dauer des Experiments müssen möglicherweise für andere Behandlungen angepasst werden.

1. Starten Sie das Mikroskop und laden Sie die optimierten Einstellungen aus Abschnitt 3.
2. Stellen Sie das Zeitrafferintervall auf 30 s und die Dauer auf 25 min ein.
3. Montieren Sie ein Deckglas mit Zellen in die Bildgebungskammer, fügen Sie 1 ml Bildgebungspuffer hinzu und stellen Sie die Kammer auf das Mikroskop.
   HINWEIS: Um eine Drift des thermischen Fokus zu vermeiden, lassen Sie die Zellen 10-15 Minuten lang auf dem Mikroskoptisch, bevor Sie mit der Zeitrafferaufnahme beginnen.
4. Verwenden Sie das Okular und das Durchlicht, um die Zellen zu fokussieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie kein Epifluoreszenzlicht, um Zellen zu lokalisieren und zu fokussieren. Selbst bei geringer Leistung wirkt sich dies nachteilig auf die Zellen aus.
5. Wechseln Sie in den Scan-Modus und verwenden Sie den 488-nm-Kanal in der Live-Ansicht, um Zellen für die Bildgebung zu fokussieren und zu lokalisieren.
6. Optional: Um die Anzahl der aufgezeichneten Zellen pro Lauf zu erhöhen, verwenden Sie die Multipoint-Funktion, um 2-3 Sichtfelder pro Deckglas abzubilden.
7. Starten Sie die Zeitrafferaufnahme und nehmen Sie 5 Bilder als 2-minütige Basisaufnahme auf.
8. Geben Sie 500 μl 3x NMDA-Lösung in die Kammer (Endkonzentration 30 μM) und zeichnen Sie weitere 20 Bilder als 10-minütige NMDA-Reaktion auf.
   HINWEIS: Neuronen reagieren sehr empfindlich auf Veränderungen der Osmolarität. Achten Sie daher darauf, die Verdunstung des Bildpuffers zu minimieren. Bei längeren Behandlungen sollte die Bildgebungskammer mit einem Deckel abgedeckt werden.
9. Geben Sie 500 μl 4x DA-Lösung in die Kammer und nehmen Sie 6 weitere Bilder auf (maximale Kalibrierung von 3 Minuten).
10. Saugen Sie den Puffer aus der Bildgebungskammer an und ersetzen Sie ihn durch 1 mL 1x DTT-Lösung. Nehmen Sie 10 weitere Bilder auf (mindestens 5 Minuten Kalibrierung).
11. Beenden Sie die Aufnahme und speichern Sie die Bildserie.

Materialien