Mikroinjektion des Gehirns von Nagetieren mit einer Quarz-Mikronadel

Abstract

Quelle: Paolone, G., et al. Personalisierte Nadeln für Mikroinjektionen im Gehirn von Nagetieren. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt die Injektion einer Mikronadel in das Gehirn eines Nagetiers mit einer Quarz-Mikronadel mit Löchern. Die Mikronadel wird an einer Spritze und einer Mikropumpe befestigt, um die Fördermenge zu steuern. Die Nadel mit der Injektionslösung wird mit niedriger Einführgeschwindigkeit in das Gehirn eingeführt. Einmal positioniert, wird die Liefergeschwindigkeit erhöht. Nach einer kurzen Pause wird die Nadel zurückgezogen.

Protocol

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden von der örtlichen institutionellen Tierpflegekommission und der tierärztlichen Prüfstelle der JoVE überprüft.

1. Vorbereitung der Quarzkanülen

1. Reinigen und sterilisieren Sie die Quarzkapillaren (siehe Materialtabelle), indem Sie sie 5 Minuten lang in destilliertes Wasser, 5 Minuten in Ethanol 99% und 5 Minuten in Diethylether legen.
2. Lassen Sie die Kapillaren mindestens 1 h unter der Haube, um sie vollständig trocknen zu lassen.
3. Bereiten Sie die Nadeln mit einem Laserabzieher nach Parametern vor, die die Herstellung einer ausreichend langen, ausreichend dünnen Nadel ermöglichen, je nach den individuellen Bedürfnissen.
   HINWEIS: Wir verwenden einen Laserabzieher (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie ein zweizeiliges Programm zum Ziehen. Die erste Linie verbraucht eine hohe Leistung, die größte Scanlänge (entspricht dem FILAMENT'S VALUE) und keine Zugkraft. Diese Kombination von Parametern führt zum Schmelzen des größten Teils der Kapillare mit der geringsten Verlängerungsgeschwindigkeit, was die Formung einer langen Nadel mit einer großen Innen-/Außengröße und einem reduzierten Schaft ermöglicht. Auf diese Weise behält die Nadel eine hohe mechanische Beständigkeit und einen großen Innendurchmesser bei, der den Durchgang von Stammzellen oder Viruspartikeln ohne Verstopfung ermöglicht. Die Geschwindigkeit und Verzögerung dieser Programmzeile soll die Kapillarausdehnung stoppen, bevor die Spitze zu klein und lang wird und die erforderlichen mechanischen und formlichen Eigenschaften fehlen. Die zweite Zeile des Zugprogramms wird automatisch ausgeführt, sobald der Quarz abgekühlt ist (5 s). Die Parameter Leistung, Filament und Zugkraft sind funktional, um eine Spitze mit der kürzestmöglichen Spitzenlänge und dem steilen Schaft zu schneiden, wodurch die Trennung der beiden Nadeln durch einen Spitzenbruch vermieden wird. Routinemäßig verwenden wir mit unserer Ausrüstung Folgendes: (a) Linie 1 = Leistung 990, Filament 5, Geschwindigkeit 130, Verzögerung 110, Zug 0; (b) Leitung 2 = Leistung 970, Glühfaden 3, Geschwindigkeit 0, Verzögerung 70, Zug 0.
4. Legen Sie die Nadeln in eine Petrischale, die zuvor mit 70% Ethanol gereinigt wurde.
   1. Decken Sie die Schale mit einer Plastikparaffinfolie ab.
5. Schneiden Sie die Kapillaren mit dem Mikrodissektor.
   1. Lassen Sie den Laser beim Start einen Autokalibrierungsprozess durchführen, um die abgegebene Leistung und Energie zu überprüfen. Stellen Sie dann die Schneidparameter ein.
      HINWEIS: Wir verwenden einen Mikrodissektor (siehe Materialtabelle) und die folgenden Parameter: Laserleistungspulsenergie (63 μJ), Laserstrahldurchmesser von 20 % der maximalen Apertur (maximale Apertur: 1,0 μm) und Schnittgeschwindigkeit von 10 % der maximalen Geschwindigkeit (maximale Geschwindigkeit: 30 μm/s).
   2. Fixieren Sie die Nadel fest auf dem Mikroskoptisch und positionieren Sie ihre Spitze in der Mitte des Computerbildschirms.
   3. Klicken Sie in der Menüleiste auf das Stiftsymbol und zeichnen Sie damit eine Markierung für das Laserschneiden der Nadel.
      HINWEIS: Der Schnitt sollte in einem Winkel von ca. 45° zur Nadeloberfläche erfolgen.
   4. Wählen Sie in der Seitenleiste die Flagge mit der Schaltfläche "START CUT" aus, damit der Laser den zuvor markierten Punkt schneiden kann.
   5. Schneiden Sie bei Bedarf die seitlichen Löcher, indem Sie die in 1.5.2-3 beschriebenen Verfahren wiederholen; die Nadel muss nicht neu positioniert werden (Abbildung 1).
6. Reinigung nach dem Schnitt.
   1. Verbinde die Nadel durch einen Kunststoffschlauch mit einer Hohlraumpumpe.
   2. Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie die Durchflussrate manuell auf eine moderate Drehzahl (3 μl/min) ein.
   3. Aspirieren Sie zuerst das 99%ige Ethanol und dann das destillierte Wasser, um Verunreinigungen durch das Schneiden zu entfernen.
   4. Aspirieren Sie das 99%ige Ethanol erneut, um das Trocknen zu erleichtern.
      HINWEIS: Jeder Schritt sollte mindestens 3 Minuten dauern.
7. Bewahren Sie die Nadeln bis zum Tag der Operation in einer gut abgedeckten Petrischale auf.
8. Nadeln können wiederverwendet werden; am Ende des Versuchs mit Bleichmittel und Ethanol reinigen, um die Lösung und mögliche Geweberückstände zu entfernen. Für eine vollständigere Reinigung legen Sie die Nadeln mit der Spitze nach unten in ein Vorratsglas für Mikropipetten, füllen Sie das Glas mit destilliertem Wasser, bis die Spitzen bedeckt sind, kochen Sie es 1,5 Minuten lang, um Gewebereste zu entfernen, und waschen Sie es dann mit Ethanol.

2. Vorgehensweise

1. Wählen Sie gemäß den Anweisungen in der Bedienungsanleitung der Pumpe das Einstellungsmenü, um die Pumpe entsprechend dem Durchmesser/Volumen der Mikroinjektionsspritze zu kalibrieren, und stellen Sie die Durchflussrate auf 0,3 μl/min ein.
2. Füllen Sie eine 10-ml-Spritze, die mit einer stumpfen Nadel (z. B. Hamilton-Nadel, 30 G) und einem kurzen Polytetrafluorethylen-Röhrchen ausgestattet ist, mit sterilem Wasser und füllen Sie damit die Mikroinjektionsspritze (nachdem Sie den Kolben sehr vorsichtig entfernt haben) und den Injektionsbaugruppensatz für die manuelle Mikroinjektionspumpe (MMP).
   HINWEIS: Das MMP-Kit wird verwendet, um die Nadel sicher im stereotaktischen Rahmen zu befestigen (Abbildung 2). Das Kit enthält einen Schlauch aus Polytetrafluorethylen, einen Luer-zu-Schlauch-Koppler, einen Pipettenhalter und Dichtungen für Pipetten mit unterschiedlichen Außendurchmessern.
3. Verbinden Sie die Nadel mit dem MMP-Kit.
   Spülen
   1. Sie mehr Wasser durch das System durch die 10-ml-Spritze und prüfen Sie, ob das Wasser aus der Nadel kommt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie alle Luftblasen im System entfernen, indem Sie die Füllschritte wiederholen.
4. Trennen Sie die 10-ml-Spritze von der Mikroinjektionsspritze, während Sie den Kolben langsam drücken, um einen Wassertropfen an der Oberseite der Mikroinjektionsspritze zu hinterlassen. Setzen Sie den Kolben in die Mikroinjektionsspritze ein.
5. Schließen Sie die Mikroinjektionsspritze an die Pumpe an und stellen Sie die Durchflussrate auf 0,3 μl/min ein
   HINWEIS: Warten Sie, bis ein Tropfen aus der Nadelspitze austritt, und lassen Sie ihn dann weitere 3 Minuten laufen.
6. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,1 μl/min ein und beginnen Sie mit dem chirurgischen Eingriff. Die Pumpe sollte während der Operation laufen.
   HINWEIS: Für die in diesem Artikel berichteten Experimente verwenden wir männliche Sprague Dawley-Ratten von 300 g (im Alter von 3 Monaten). Das Verfahren ist jedoch auf andere Spezies anwendbar, insbesondere auf Mäuse.
7. Induzieren Sie eine Vollnarkose mit einer Methode, die nach den örtlichen Vorschriften zugelassen ist.
   HINWEIS: Wir verwenden eine Mischung aus intraperitonealer Injektion (i.p.) von 85 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin für 20-50 Minuten Anästhesie. Es ist wichtig, dass Schwanz- und/oder Zehenkneifungen verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert ist. Der Grad der Anästhesie und die grundlegenden Vitalwerte werden vor Beginn der Operation beurteilt und während der Operation alle 10 Minuten überwacht. Die Körpertemperatur des Tieres wird vor, während und nach chirurgischen Eingriffen mit einem wasserumwälzenden Heizkissen konstant gehalten. Die Tiere werden überwacht, bis sie sich vollständig erholt haben (z. B. sie sind aufrecht und gehfähig). Zusätzlich erhalten die Tiere postoperativ alle 24 Stunden über einen Zeitraum von drei Tagen Analgetika (Tramadol, 5–7 mg/kg i.p.).
   1. Rasieren Sie den Kopf des Tieres und bereiten Sie die Operationsstelle angemessen für die aseptische Operation vor. Führen Sie ein zweistufiges Peeling mit einer Lösung auf Jodbasis (Betadin) durch, gefolgt von 70% Ethanol. Um die Asepsis aufrechtzuerhalten, umwickeln Sie die Operationsstelle mit einem OP-Tuch (im Video wurde zu Demonstrationszwecken weggelassen).
8. Positionieren Sie die Ratte im stereotaktischen Rahmen über einer wasserumlaufenden Heizdecke. Um eine zusätzliche Schmerzlinderung zu erzielen, tragen Sie an der Operationsstelle 0,5% ige Lidocainlösung auf (nicht überschreiten Sie 7 mg/kg). Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit einem Perlsterilisator oder einer flüssigen Kaltdesinfektion, indem Sie das Gerät entweder in 2 % Glutaraldehyd plus 7,05 % Phenol (Sporodicin oder Cidex) tauchen, gefolgt von einer Spülung mit sterilem Wasser oder Kochsalzlösung. Die Desinfektion muss auch zwischen den Eingriffen durchgeführt werden. Machen Sie mit einem sterilisierten Skalpell einen Längsschnitt über den Schädel. Seien Sie vorsichtig, um übermäßige Blutungen zu vermeiden. Öffnen Sie die Kopfhaut mit einem flachen Spatel und kleben Sie chirurgische Klammern auf die Hautlappen, um sie offen zu halten. Lösen Sie sehr vorsichtig das Periost, um das Bregma und den Bereich des Schädels, durch den die Nadel eingeführt wird, freizulegen.
9. Montieren Sie den Arm auf dem stereotaktischen Rahmen (während der Fluss andauert) und bewegen Sie die Spitze der Nadel genau auf dem Bregma, wobei Sie darauf achten, dass die Spitze nicht bricht. Annotieren Sie die antero-posterioren und medio-lateralen Koordinaten des Bregmas und übersetzen Sie sie in die gewünschten Koordinaten. Senken Sie die Nadel unter Anleitung eines Stereomikroskops ab, bis ihre Spitze fast den Schädel berührt, markieren Sie die Bohrstelle, nachdem Sie den stereotaktischen Arm ein wenig angehoben haben.
10. Bohren Sie den Schädel (Bohrspitze Ø: 0,8 mm; Bohrgeschwindigkeit: 1.000 U/min) an der markierten Stelle. Es muss darauf geachtet werden, dass während der Bohrvorgänge nicht in die Dura eingedrungen wird. Während des Bohrens tropfen Sie sterile Kochsalzlösung auf, um Knochenschäden und Nekrosen zu vermeiden.
11. Schneide ein kleines Stück Paraffinfolie aus Plastik ab und lege es auf den Schädel. Mit der 10-μl-Pipette einen Tropfen der Lösung herstellen, um sie auf den Kunststoffparaffinfilm zu injizieren. Stoppen Sie die Pumpe, ziehen Sie den Drücker der Pumpe leicht zurück und erzeugen Sie eine kleine Luftblase in der Kapillare, indem Sie vorsichtig am Kolben der Mikroinjektionsspritze ziehen.
12. Senken Sie den stereotaktischen Arm ab, bis die Spitze der Nadel den Tropfen erreicht. Entnehmen Sie die Probe, indem Sie (sehr langsam) am Kolben der Mikroinjektionsspritze ziehen, um Blasenbildung zu vermeiden. Setzen Sie den Pumpenschieber in Kontakt mit dem Kolben wieder ein und schalten Sie die Pumpe mit einer Durchflussmenge von 0,3 μl/min ein. Warten Sie, bis sich ein Tropfen gebildet hat (einige Minuten), bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    HINWEIS: Im vorliegenden Beispielexperiment wurde künstliches Liquor cerebrospinalis (aCSF) in das Striatum infundiert [AP (anteroposterior): +1,5, ML (mediolateral): ±2,7; DV (Dorsoventral): -5,0] und im dorsalen Hippocampus (AP: -3,5, ML: ±2,1; DV: -3,5; in mm von Dura), 2 μL/Stelle. Um den Vergleich zwischen den beiden Injektionsmethoden zu erleichtern, wurde jedes Hirnareal mit einer Quarznadel in der einen Hemisphäre und einer 26 G stumpfen Spitze oder einer 30 g Edelstahlnadel mit abgeschrägter Spitze in der anderen Hemisphäre infundiert.
13. Senken Sie den Durchfluss auf 0,1 μl/min, schneiden Sie die Dura mit einer abgeschrägten Nadel aus Edelstahl ein und senken Sie den stereotaktischen Arm langsam auf die dorso-ventrale Achse, um in das Hirngewebe einzudringen. Wenn die gewünschte Position erreicht ist, gehen Sie weitere 0,1 mm nach unten, stoppen Sie die Pumpe, heben Sie den stereotaktischen Arm um 0,1 mm an und starten Sie die Pumpe wieder bei einem Durchfluss von 0,3 μl/min.
    HINWEIS: Der Grund für die Aufrechterhaltung eines langsamen Flusses beim Absenken der Nadel besteht darin, einen Überdruck zu gewährleisten, der das Eindringen kleiner Gewebefragmente in die Nadel selbst verhindert. Ein solches Ereignis würde die Spitze blockieren und die Abgabe der Lösung beeinträchtigen. Da die Flussrate beim Absenken der Nadel sehr langsam ist und die Geschwindigkeit des Absenkens etwa 10 s/mm beträgt, bedeutet dies, dass die entlang der Nadelbahn verbleibenden Lösungsmengen im Vergleich zu denen, die an der Zielstelle injiziert werden, vernachlässigbar sind. Diese Vorsichtsmaßnahme kann vermieden werden, wenn Nadeln mit seitlichen Löchern verwendet werden.
14. Starten Sie den Timer und warten Sie je nach gewünschtem Injektionsvolumen die erforderliche Zeit (z. B. 6 min 40 s bei Injektion von 2 μl). Überwachen Sie die Bewegung der Blase während der Injektion. Stoppen Sie am Ende die Pumpe und warten Sie 5 Minuten, bevor Sie die Nadel langsam herausholen. Wenn die Quarznadel vollständig herausgezogen ist, starten Sie die Pumpe erneut und prüfen Sie, ob sich an der Spitze der Nadel ein Tropfen gebildet hat.
15. Versiegeln Sie die Öffnung in der Schädeloberfläche mit Knochenwachs, entfernen Sie die hämostatischen Klammern und nähen Sie die Kopfhaut, bestreichen Sie den Bereich um die Wunde mit einer antibiotischen Creme (z. B. Neosporin) und bringen Sie das Tier in den Heimkäfig zurück.

Results

Abbildung 1: Mikroskopische Aufnahme einer Quarznadelspitze, die unterschiedliche Durchmesser der Spitze und Löcher zeigt, die für die Injektion von Flüssigkeiten verwendet werden. Bild mit geringer Vergrößerung in (A) und höherer Vergrößerung...

Materials